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CRISPR编辑，为什么越来越多实验选择Cas9 RNP？
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在做CRISPR基因编辑时，研究人员往往会先从质粒转染开始，因为这套方法材料容易准备，在常规细胞系中也很常用。它的原理大致是先将Cas9和sgRNA（向导RNA）的表达序列送进细胞，等细胞转录出sgRNA并翻译出Cas9蛋白后，Cas9蛋白再与sgRNA结合，最后识别并切割目标位点。 但是实验对象换到原代细胞、干细胞或其他对外源DNA较敏感的细胞后，这套方法就容易受到限制。比如，质粒即使已经进入细胞，Cas9和sgRNA的表达仍会受到启动子活性和细胞状态影响。还有，由于Cas9在细胞内持续表达的时间较长，即使目标位点已经发生编辑，新的Cas9还可能继续产生。 而Cas9 RNP提供了另一种选择。它是由Cas9蛋白和sgRNA预先结合形成，在送入细胞的时候已经是可以工作的编辑复合物。因此，这套方法无需在细胞内表达Cas9，起效快、作用时间相对短，也不会引入Cas9表达质粒。但其关键难点在于如何让大分子RNP顺利进入细胞，同时维持细胞活力。 优势在于见效快且不引入Cas9表达质粒 Cas9 RNP起效较快，主要与送入细胞时的分子状态有关。与质粒转染不同的是，RNP在细胞外已经完成Cas9蛋白与sgRNA的组装，在进入细胞并完成释放后，可以更快地识别目标序列。 Kim等人在2014年的研究中，将纯化的Cas9蛋白与sgRNA组成RNP后直接递送到人细胞。研究发现，RNP进入细胞后很快产生基因组切割，突变频率在一天左右达到平台期。随后，RNP会被细胞逐步降解，活性Cas9在细胞内停留的时间相对较短，并在所检测的位点上减少了与质粒转染相关的脱靶编辑。 因此，对于希望Cas9尽快起效，并在完成编辑后较快消失，以及细胞难以稳定表达外源Cas9，或者不希望引入Cas9表达质粒的实验，RNP更值得考虑。但如果实验需要Cas9或其融合蛋白长期表达，则要根据研究目的选择其他递送形式。 难点在于递送 Cas9 RNP之所以难递送，首先与它本身的结构有关。Cas9是大分子蛋白，sgRNA是带负电的核酸，两者结合后形成的RNP分子较大，并带有较多电荷。这类大分子复合物会被细胞膜阻挡。因此，RNP不能仅靠加入培养基就自行进入细胞。 另外，即使借助转染试剂被细胞摄取，也不代表RNP已经能够参与基因编辑。通过内吞进入细胞的RNP通常会被包裹在内体中，如果长时间滞留在内体中，或者随后进入溶酶体并被降解，能够接触目标基因的有效RNP就会减少，最后的编辑效果也就变差。 所以，理想的RNP递送系统是，既能帮助大分子复合物进入细胞，也能促进其在胞内释放，同时还要尽量维持RNP活性和细胞状态。 目前，电转和化学转染都可用于Cas9 RNP递送。电转通过短暂提高细胞膜通透性，使RNP进入细胞。化学转染则利用转染试剂与RNP形成复合物，促进细胞摄取和胞内释放。Zuris等人的研究表明，阳离子脂质可以将Cas9与sgRNA复合物递送到培养的人细胞中，并产生基因组编辑。 让RNP顺利进细胞 由于RNP在分子大小和组成上不同于质粒与siRNA，其递送需要采用与RNP特性相匹配的转染体系。所以针对RNP的递送需求，达远辰光提供LL TransR RNP转染试剂。该产品根据RNP分子的结构和作用特点设计，可与RNP形成递送复合物，促进细胞摄取和胞内释放，有助于在获得有效编辑的同时减少转染处理对细胞状态的影响，为后续基因型分析和功能验证提供稳定的实验基础。 参考文献： [1] Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 2014, 24(6), 1012至1019. [2] Zuris JA, Thompson DB, Shu Y, et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 2015, 33(1), 73至80. |
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