| 查看: 32 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
实验技巧｜小提质粒提升浓度实用大法！
|
| 在质粒提取中，浓度突破 1000 ng/μL 是很多同学梦寐以求的目标。高浓度意味着更少的转染体积、更高的共转染效率，也为下游显微注射、动物实验等铺平道路。今天我就结合一份真实操作记录，逐帧拆解每一个关键节点，并补充那些容易遗漏却决定成败的“隐藏步骤”，帮你把质粒小提做到大提级别的浓度。一、摇菌-量不在多，精在“对数”从平板上挑取单克隆菌落，接种于小摇管（如 3~5 mL 含抗生素 LB）中，先进行一级活化（37℃，200 rpm，约 6~8 h）。取上述活化菌液 200 μL，转接至 15 mL 含抗生素的 LB 培养基中（共制备 2 管，总体积 30 mL），置于 50 mL 离心管中。摇菌条件：37℃，200 rpm，摇 13~14 h。🔑 点拨：这个时间点正好卡在对数生长后期，菌体密度高且质粒拷贝数处于峰值。若摇过久（>16 h），菌体老化自溶，质粒反而下降。二、离心收集菌体 - 宁可多取，不可少取将每管菌液分别倒入 1.5 mL EP 管中，每次 1 mL，12 000 rpm 离心 1 min，弃上清，重复收集，直至全部菌液沉淀完。两管菌液分别得到两个菌体沉淀。⚠️ 注意：建议每管至少收集 8~10 次（即 8~10 mL 菌液），保证起始菌量充足，这是高浓度的基础。三、Buffer P1 重悬 - 温柔而彻底提前在 Buffer P1 中加入 RNase A（按说明书比例），并储存于 4℃。向每管沉淀中各加入 500 μL Buffer P1。使用移液器反复吹打，或涡旋振荡至完全无块状菌体，形成均匀的菌悬液。💡 重悬不彻底，后续裂解会不均一，得率直接打八折。四、裂解与中和-黄金 5 分钟，手速要快向每管中分别加入 500 μL Buffer P2（含 SDS + NaOH），立即上下颠倒 6~10 次，直至溶液变得澄清透亮、粘稠（说明菌体已完全裂解）。严格控制在 5 分钟之内，加入 500 μL Buffer P4（或中和液），同样立即颠倒 6~10 次，可见白色絮状沉淀（蛋白质和基因组 DNA 析出）。室温静置 10 min，然后 12 000 rpm 离心 10 min。🕐 关键：P2 作用时间超过 5 分钟会使质粒断裂；P4 加入后颠倒要迅速，中和不充分会导致后续滤柱堵塞。五、CS 柱过滤 -避开“白色幽灵”小心吸取离心后的上清，切勿吸到白色细小沉淀（那是蛋白-基因组复合物），否则会堵塞 CS 柱。将上清分批加入 CS 过滤柱（每次不超过 700 μL），12 000 rpm 离心 2 min，收集滤液至新的 2 mL EP 管中。准确记录滤液总体积（这一步很多人忽略，但后续计算异丙醇用量全依赖它）。六、异丙醇沉淀 - 体积可以“抠”一点根据滤液体积，加入 0.3 倍体积的异丙醇（例如滤液 1294.6 μL，理论加 388.4 μL，实际可加 385 μL，适当减少无妨）。上下颠倒混匀，室温静置 3~5 min（让核酸充分析出）。🧪 异丙醇略减量反而能减少盐类共沉淀，对纯度有益。七、CP4 柱吸附 - 别急着离心，先“泡一泡”提前平衡 CP4 柱：向每个 CP4 柱中加入 500 μL Buffer BL，12 000 rpm 离心 1 min，弃滤液（此步骤务必先做！）。将上述混合液分次加入平衡好的 CP4 柱中（两管菌液各用一个吸附柱）。关键操作：加样后室温静置 3~5 分钟，让质粒 DNA 与硅胶膜充分结合，然后再 12 000 rpm 离心 1 min，弃滤液。📌 静置这一步很多人跳过去，但它是提高结合效率的“隐形杠杆”。八、洗涤 - PD 与 PW 的“前后夹击”Buffer PD 洗涤：向每个 CP4 柱加入 500 μL Buffer PD（去蛋白），12 000 rpm 离心 1 min，弃滤液。Buffer PW 洗涤：向每个柱子加入 600 μL Buffer PW（已加无水乙醇），静置 3 分钟（让残留盐充分溶解），然后 12 000 rpm 离心 1 min，弃滤液。空离除醇（⭐ 补充关键步骤）：将 CP4 柱放回收集管，12 000 rpm 空离 2 min，并打开管盖于室温放置 3~5 min，使乙醇彻底挥发。🔥 乙醇残留会严重抑制下游酶切和转染，空离+晾干是提浓度的“隐形卫士”。九、终极洗脱 -“串联洗脱”法，浓度翻倍这是本方案最精华的“浓缩大法”：第一次洗脱（柱1）：用 200 μL 预热至 60℃ 的 ddH₂O 滴入第一个 CP4 柱膜中央，60℃ 静置 2 min，12 000 rpm 离心 1 min，收集洗脱液。重复洗脱柱1：将同一份洗脱液再次加回柱1膜上，静置 2 min，再次离心。此时柱1的大部分质粒已被洗脱。转柱洗脱（柱2）：取 20 μL 预热 ddH₂O 先浸润第二个 CP4 柱的膜（使其活化）。然后将柱1的洗脱液（约 200 μL）全部吸出，加到柱2的膜中央，60℃ 静置 2 min，离心收集。重复洗脱柱2：将洗脱液再次加回柱2，静置 2 min，离心，最终得到约 200 μL 的高浓度质粒溶液。🏆 解读：这种方法相当于用同一份洗脱液“串行”流过两个柱子，把两个柱子的质粒富集到同一体积中，浓度可提升 1.6~2 倍。1000 ng/μL 就是这样“挤”出来的。十、后续检测与保存取 1~2 μL 测 OD260/280（应介于 1.8~2.0），并计算浓度。分装成小管（避免反复冻融），-20℃ 保存。若长期保存，建议 -80℃。 |
回复此楼» 猜你喜欢
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有123人回复
-
今天基金会出结果吗？20260819
已经有13人回复
-
时间戳变了，能看出什么问题？
已经有16人回复
-
filecode，4个jtjc了
已经有13人回复
-
为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？
已经有5人回复
-
今天放榜没戏了吧
已经有5人回复
-
今天放榜吗？
已经有15人回复
-
filecode=后面第一个是大写字母
已经有12人回复
-
2027广东省杰青
已经有10人回复
-
朋友圈看到的
已经有8人回复
