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侧翼

[交流] 测序错误

大家好,我现在在做一个600bp左右的片段,正向反向测序都是同一位点的两个碱基错误。pcr用的是一般的Taq酶,想问一下有没有必要换为高保真酶。谢谢!

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-27 at 13:30 ]
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fykxy_206

木虫 (正式写手)

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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 11-20 14:30
怎么确定测序错误的?你有标准的序列还是跟genebank上比较的?错误可能是Taq酶的原因,但是两次PCR测序的结果都是那个碱基错误的话就不是酶的原因了。就可能是你的模板的原因。就是那个位点的碱基突变了。
2楼2009-11-20 10:44:59
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solopen

铜虫 (初入文坛)


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用Taq酶有一定的不匹配性,最好换一下高保真的
另外有可能你的基因片段此位点就是这个碱基
3楼2009-11-20 10:46:47
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liyong1981

金虫 (正式写手)



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有可能是突变哦,不错,发现了一个分子标记,高保真酶不见得比普通的好扩增的好,个人实践证明~
4楼2009-11-20 11:20:42
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foreverjohn

金虫 (小有名气)

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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 11-20 14:29
问题是用PCR产物测序还是菌落克隆测序,如果是菌落克隆测序的话,就很有可能是那个位点发生了突变(要么是本来就存在,要么是PCR错配),因为已经正向和反向测序证实!如果是PCR片段直接测序的话,应该就是本来就存在这样一个突变,因为如果是PCR引入的话,就是随机的,不可能就发生在那个碱基上,不知道我的分析对楼主有没有用。
5楼2009-11-20 12:50:08
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priorpost06

至尊木虫 (著名写手)


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我觉得引物的设计可能有问题,因为你总是那个碱基错误,PCR的酶只是催化聚合,就算是在高保真的酶,也不会自动改正吧,最终,怎么去合成你需要的碱基,还是得按照引物的顺序。
6楼2009-11-20 13:03:21
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主

怎么判断正反都错了呢
7楼2009-11-20 15:01:54
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

Taq酶只能用于筛选
8楼2009-11-20 18:57:03
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人


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lz的模板是已知序列吧
再扩一次,用高保真的酶,
如果那个碱基不影响翻译,倒不妨试试,
小木虫之有关部门负责人
9楼2009-11-20 19:07:50
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hyde0706

木虫 (正式写手)


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已知序列吗?有没有可能是SNP?如果可以排除的话肯定是taq酶的错误延伸了,一般taq酶错误率好像在千分之一。
10楼2009-11-20 20:53:03
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