| 查看: 74 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
快速鉴定阳性克隆｜菌落 PCR 实操步骤 + 核心细节
|
|
在分子克隆实验中，菌落PCR是鉴定阳性转化子的“黄金快筛”手段。无需提取质粒，直接以单菌落为模板，结合特异性引物和琼脂糖凝胶电泳，数小时内即可判断目标基因是否整合。本文基于实战经验，系统梳理完整操作步骤、关键细节与常见雷区，助你一次跑出清晰条带。一、原理与适用场景菌落PCR的核心优势在于跳过质粒抽提，将细菌菌落直接作为PCR模板。由于大肠杆菌细胞壁较薄，经高温预变性即可裂解释放DNA，足以满足常规扩增需求。该方法适用于：转化后平板上的阳性克隆初筛；重组子插入片段大小验证；多克隆位点方向性鉴定。注意：菌落PCR仅作初步鉴定，最终阳性结果需经测序确认。 二、实验前准备（试剂与耗材清单）🔬 耗材类无菌200 µL PCR薄壁管（八联排或单管）无菌7.5 mL EP管（摇菌用）10 µL、200 µL、1000 µL移液枪及对应灭菌枪头200 µL带滤芯枪头（用于挑取菌落，减少污染）封口膜、泡沫漂浮板（摇床固定用）制胶槽、梳齿、电泳槽、微波炉、凝胶成像系统🧪 试剂类含氨苄青霉素（Amp）的LB固体平板（新鲜配制，4℃保存）含Amp的LB液体培养基（现用现配或预温至37℃）无菌去离子水（PCR级）2× PCR Master Mix（含Taq酶、dNTPs、Mg²⁺及电泳指示染料）上下游特异性引物（推荐浓度10 µM）DNA分子量标准（DNA Marker）琼脂糖粉、1× TAE电泳缓冲液（注意：必须使用1×工作液，原文“7×”为笔误，50×或20×母液需稀释至1×）核酸染料（如GelRed或EB，使用浓度按说明书）6× DNA Loading Buffer（备用，若Mix不含染料时添加）50%无菌甘油（保菌用，由纯甘油与无菌水1:1配制并高压灭菌）三、详细实验步骤（分阶段操作）阶段Ⅰ：挑取单菌落与初始扩培标记与分区 在超净工作台内，用记号笔在PCR管盖和管壁标记编号（如1~10），同时在7.5 mL EP管上标注对应菌株代号及日期。加入无菌水 每支200 µL PCR管中预先加入 8 µL 无菌去离子水（作为菌体稀释液）。平板标记与挑菌从37℃过夜培养的转化平板中，选取分散良好、单克隆且大小均一的菌落（建议5~10个）。用10 µL无菌枪头（或200 µL枪头套上10 µL小枪头，增加挑取精准度）轻触菌落表面，蘸取极少量菌体（肉眼可见微黄即可），立即在PCR管水中旋转涮洗，使菌体分散。分装稀释菌液用移液枪从上述PCR管中吸取 4 µL 菌液悬液，转移至装有 7 mL LB液体培养基（含Amp） 的7.5 mL EP管中。用封口膜密封管口，置于泡沫浮板上，放入37℃摇床，200 rpm振荡过夜（约12~16 h）。剩余4 µL 菌液留在PCR管内，直接作为菌落PCR模板（无需离心或煮沸）。⚠️ 关键点：摇菌时间不宜超过16小时，否则Amp可能失效，导致质粒丢失或杂菌生长。阶段Ⅱ：菌落PCR扩增反应配制PCR反应体系（冰上操作） 以25 µL总体系为例（可根据需要调整）：组分体积2× PCR Master Mix（含染料）12.5 µL上游引物（10 µM）0.5 ~ 1.0 µL下游引物（10 µM）0.5 ~ 1.0 µL模板（上述稀释菌液）4 µL无菌去离子水补足至25 µL引物设计策略：强烈推荐使用载体骨架上的通用引物（如M13-F）与目的基因特异性引物配对，或使用一对跨越插入片段的引物。这样可避免空载体假阳性，仅阳性克隆才扩增出目标大小条带。设置PCR程序（常规参数）变性：95℃ —— 30 s退火：根据引物Tm值（通常55~60℃）—— 30 s延伸：72℃ —— 1 min/kb（按目标片段长度调整）预变性：95℃ —— 10 min（务必延长至10 min，确保细菌细胞充分裂解）循环扩增（30~35 cycles）：终延伸：72℃ —— 5~10 min保温：4℃ —— 保存PCR产物取出后短暂离心，直接用于电泳（因Mix含染料，无需额外加Loading Buffer）。 阶段Ⅲ：琼脂糖凝胶电泳鉴定制备凝胶（浓度选择原则）1% 凝胶配制实例（100 mL）： 称取 1.0 g 琼脂糖粉 于锥形瓶中，加入 100 mL 1× TAE 缓冲液，微波炉加热至完全溶解（溶液透明无颗粒）。冷却至 约60℃（手触瓶壁不烫），加入 核酸染料（终浓度按产品说明，如GelRed 1:10000），轻轻混匀后倒入制胶槽，插上合适梳齿，室温静置 30 min 至凝胶完全凝固。片段 < 500 bp：建议 2% 凝胶片段 500~2000 bp：建议 1.2% 凝胶片段 > 2 kb：建议 0.8%~1.0% 凝胶上样与电泳拔除梳齿，将凝胶放入电泳槽中，加满 1× TAE 浸没胶面。每孔上样 5~10 µL PCR产物（无需额外加Loading Buffer）。同时点加 DNA Marker（5 µL）。盖好盖子，连接电极（正极接红色，负极接黑色），设置电压 100~130 V，电泳时间约 30~40 min（或根据溴酚蓝指示剂位置判断，待其迁移至胶全长2/3处停止）。成像与分析 将凝胶置于紫外或蓝光透射仪下观察，阳性克隆应出现与预期大小一致的特异性单一条带，空载体或阴性对照无此条带。 阶段Ⅳ：阳性克隆的扩培、测序与保存过夜菌液处理 摇至过夜的7.5 mL菌液，取 500 µL 送测序公司（使用载体通用引物进行测序验证）。剩余菌液视情况：若电泳结果阳性，可直接取剩余菌液进行甘油保菌（见下文）；若需扩大培养，可从原平板重新挑取同一阳性单菌落，接种至新鲜LB（含Amp）中扩大培养，避免长期摇瓶导致突变。甘油保存菌种（长期保藏）配制50%甘油：量取等体积纯甘油与无菌去离子水，混匀后高压灭菌（121℃，20 min），冷却备用。在超净台内，取 0.5 mL 过夜菌液 与 0.5 mL 50%甘油（终浓度约25%）于无菌冻存管中，或菌液0.6 mL + 甘油0.4 mL（终浓度20%），轻柔颠倒混匀（勿剧烈振荡）。管壁标注：菌株名称、质粒信息、保存日期、代数（如P0）及操作人姓名。短期保存可放 -20℃（半年内），长期保存应置于 -80℃ 或液氮气相层。 核心要点总结无菌操作：挑菌、分装、保存全过程必须在超净台完成，耗材需高压灭菌。引物设计：优选“载体引物 + 基因特异性引物”组合，降低假阳性。凝胶浓度：根据片段大小灵活调整，大片段用低浓度，小片段用高浓度。电泳缓冲液：只能用1× TAE（不可用TBE或其他），且必须新鲜配制。保菌时机：鉴定阳性后第一时间保菌，避免多次传代导致突变。 |
回复此楼» 猜你喜欢
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有5人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有11人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有3人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有57人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有9人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有3人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有3人回复
-
关于Filecode分析方法
已经有13人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
