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拒绝高背景！免疫荧光实验结果图异常逐步排查及优化
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免疫荧光实验结果异常可以从四个层面进行排查：组织/细胞形态是否正常、靶蛋白定位是否准确、信号强度怎样、是否有高背景？在这些问题中，完全没有信号也许不是棘手的，而靶蛋白有信号，其周围同时出现大面积的弥散荧光、颗粒状亮点或者多通道信号重叠，可能会更棘手。因为增加一抗浓度、提高曝光这些改进只会让图像更亮，而不能提高结果的可信度。 一、如何排查高荧光背景？ 高背景是非特异性信号增多，影响特异信号的识别，常用信噪比表示。高背景大致可以分为四类：样本自发荧光、抗体或检测试剂的非特异性结合、实验操作不当、成像参数或通道设置。 背景表现 优先排查方向 未染色样本在相同通道下发亮 组织自发光、固定剂诱导荧光、载玻片或封片剂背景 去除一抗后仍有明显荧光 二抗非特异性结合、内源性免疫球蛋白、Fc受体结合 仅完整染色组背景升高 一抗浓度过高、交叉反应或不匹配 多个通道显示相似的颗粒或组织轮廓 自发荧光或通道串色 血管壁、纤维组织等发亮 胶原、弹性蛋白等组织成分自发光 胞质内出现跨通道的粗大颗粒 存在脂褐素等内源性荧光物质 切片边缘、裂隙或局部异常明亮 干片、试剂覆盖不均或组织损伤 厚组织整体出现雾状荧光 抗体滞留或洗涤不足 相邻通道同步出现阳性结果 光谱重叠、曝光过高或信号采集串扰 二、合理设置对照进行排查 实验结果出现高背景，我们不建议直接更换封闭液或延长洗涤时间或次数，更有效的方法是利用连续切片或同批细胞，合理设置对照进行排查。当然为了更好的排查异常结果及增强结果的可信度，我们要养成设置对照的好习惯。（你是否吃过不设对照的苦呢？） 1、不染色对照 同一批样本在完成固定、修复、通透和封闭流程后，取其中1-3个切片不进行一抗、二抗孵育和荧光染色过程。设置该对照的目的是观察组织、载玻片和封片介质本身的荧光。如果对照组出现与实验组类似的结果，说明存在自发荧光情况。 2、二抗对照 省略一抗孵育，其他操作与实验组相同。如果不染色对照正常，二抗对照明显发亮，则问题出在二抗体系，比如二抗存在交叉反应、Fc受体介导的结合或二抗识别样本中的内源性免疫球蛋白。 3、完整染色组 如果前两组对照背景正常而完整染色组出现异常，我们需要重点排查一抗浓度、抗体特异性以及固定、通透、洗涤等操作过程。 4、阳性和阴性对照 这是常规实验必须设置的对照。已知表达或不表达靶蛋白的细胞或组织，能够判断实验结果的定位是否正确。阳性对照用确定含有靶蛋白的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。阴性对照与阳性对照相反，用明确不含靶蛋白的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。 多色免疫荧光实验还应该增加每个标志物的单染对照，判读通道串色和补偿设置。 三、基于排查进行优化 1、处理组织自发光 组织自发荧光可能来自胶原、弹性蛋白、脂褐素、红细胞等内源性成分，也可能由醛类固定产生或增强。硼氢化钠、苏丹黑B及其它淬灭剂能够降低石蜡切片的自发荧光，但效果具有组织和通道依赖性，也可能会削弱靶蛋白信号或改变光谱特征。因此，使用淬灭剂需要在同一批切片上进行验证。 旧甲醛溶液容易产生自发荧光，建议更换新鲜配制的甲醛固定液，或使用4%多聚甲醛溶液，减少甲醇的影响。样本固定后要充分洗涤。在封闭液中添加终浓度为0.3mol/L甘氨酸以降低自发荧光，或者使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭。 2、对一抗和二抗进行优化 抗体浓度过高会使低亲和力结合位点和组织滞留信号被同步放大，可采用梯度滴定实验进行优化，以目标结构清晰、阴性区域荧光低为判断标准。通过设置敲除/敲低靶蛋白的阴性对照，判断一抗是否存在非特异性结合。若存在需使用与样本物种不同种属来源的抗体，并且经过实验验证适用于免疫荧光检测。 3、优化封闭、通透、洗涤等操作细节 封闭液需要与抗体体系和样本类型匹配，优选二抗来源物种的血清，也可以根据体系选择合适的蛋白封闭剂。延长封闭时间有助于减少背景。 Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质，促进抗体进入胞浆和胞核。但通透过强会破坏膜结构、释放可溶性物质或增加非特异性结合的机会。膜蛋白、胞质蛋白、核蛋白适宜的通透条件存在差异，应根据实验目的进行优化。 高背景可能与洗涤步骤有关，可以增加洗液体积、洗涤次数和温和振荡，不建议直接提高去污剂的浓度。在整个孵育过程中还要避免切片或细胞干燥。局部干片会造成边缘荧光增强和组织轮廓异常。 高背景优化遵循“一次只改变一个变量”的原则，避免同时更换抗体、封闭液、曝光参数等。我们可以建立优化记录表，将样本类型、固定条件、通透、封闭以及抗体孵育体系进行记录，并与图像文件一一对应，实现高效排查，让结果可信可重复。  |
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