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原核表达怎么做？大肠杆菌 His 融合蛋白纯化实操攻略
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本文系统整理了大肠杆菌表达系统（BL21(DE3)）中His标签重组蛋白的诱导表达与镍柱亲和层析纯化方案，涵盖菌株转化、逐级放大培养、IPTG诱导、超声破碎及Ni柱梯度洗脱等核心步骤，并补充诸多实际操作细节与常见问题对策，助你一站式完成高质量蛋白样品制备。 第一天：质粒转化（构建表达菌株）1. 转化感受态细胞取 1～2 μL 重组质粒（含His标签编码序列）加入 50 μL BL21(DE3) 化学感受态细胞中，冰上静置 30 min。42℃ 热激 45～90 s，立即冰浴 2 min。加入 500 μL 无菌LB培养基（不含抗生素），37℃，200 rpm 复苏培养 45～60 min。取适量复苏菌液涂布于 含相应抗生素（如卡那霉素50 μg/mL或氨苄青霉素100 μg/mL）的LB平板，37℃倒置培养过夜（12～16 h）。✅ 关键点：抗生素种类必须与质粒抗性标签一致，平板划线宜采用“分区划线”法以获得单克隆。第二天下午或傍晚：小摇培养（种子液制备）2. 小摇活化从平板上挑取 单一阳性克隆（直径约1～2 mm），接种于 5 mL LB液体培养基（含相应抗生素）的摇菌管中。置37℃恒温摇床，200 rpm 振荡培养 8～10 h（至培养基明显浑浊，OD₆₀₀ ≈ 0.6～1.0）。📌 推荐做法：同时保留平板于4℃，作为后续再划种的母板；小摇时间不宜过长，避免菌体老化或质粒丢失。第三天早上：大摇培养与IPTG诱导3. 大摇扩增按 1:100 比例，取 5 mL 小摇菌液（或适当体积）接种至 500 mL 新鲜LB液体培养基（含抗生素）中（摇瓶体积应为培养基的3～5倍，保证充分通气）。37℃，200 rpm 振荡培养 1～3 h，期间每隔30 min取样测定OD₆₀₀。4. IPTG诱导（关键步骤）当 OD₆₀₀ 达到 0.6～0.8（对数生长中期）时，加入 IPTG 至 终浓度 0.1～0.5 mmol/L（常用0.5 mM，具体浓度需依据预实验优化）。诱导条件三选一（根据蛋白特性选择）：低温长时：16℃，振荡16 h（提高可溶性，推荐用于易形成包涵体的蛋白）；中温过夜：28℃，振荡8 h（平衡产量与活性）；高温快速：37℃，振荡3 h（产量高但可能以包涵体为主）。⚠️ 重要提醒：IPTG浓度、诱导温度和时间须以前期小量诱导（SDS‑PAGE验证） 确定的最佳条件为准。诱导时可留取1 mL诱导前菌液和1 mL诱导后菌液，用于后续电泳检测表达效果。第四天早上：菌体收集与蛋白纯化5. 收集菌体诱导结束后，将菌液倒入离心瓶，5,000 × g，4℃ 离心 10 min。弃上清，称量菌体湿重（便于后续计算缓冲液体积）。按 每100 mL原始菌液对应10～20 mL His结合缓冲液 的比例，加入适量预冷缓冲液，充分重悬菌体（可用移液枪吹打或涡旋，至无肉眼可见团块）。🧊 暂存：若不能马上破碎，可将菌悬液（或沉淀）冻于‑80℃（沉淀可保存数周，重悬液建议‑20℃短期保存）。6. 超声破碎（冰上操作）将重悬液转移至 50 mL 离心管（或专用破碎杯），插入装满冰块的烧杯中，确保全程低温。超声波破碎仪参数：功率 30%（或输出功率200～300 W），总超声时间10 min，开4 s / 关4 s 脉冲模式（实际有效超声时间约5 min）。破碎终点：菌液由浑浊变为半透明、流动性增强（若仍粘稠，可追加超声至15 min）。🧪 防降解措施：若目标蛋白对蛋白酶敏感，超声前加入DTT至终浓度1 mmol/L（或同时加入PMSF 1 mmol/L），以抑制内源蛋白酶活性。DTT还可防止含半胱氨酸的蛋白氧化聚集。7. 离心去除细胞碎片破碎后立即于 12,000 × g，4℃ 离心 15 min。小心吸取 上清液（含可溶性His融合蛋白），转移至新离心管中，避免吸入底部沉淀。取样检测：取少量上清和沉淀（重悬于等体积结合缓冲液）留作SDS‑PAGE样品，以评估蛋白可溶性比例。💡 若上清仍浑浊，可用 0.45 μm滤膜 过滤，防止堵塞后续Ni柱。8. Ni柱亲和纯化（全过程在4℃冷库或层析柜中进行）① 介质准备与平衡取 600 μL Ni‑NTA琼脂糖树脂（或根据样品量调整，一般每10 mL上清用200～500 μL树脂）加入 纯化柱（重力柱） 中。洗涤介质：先后加入 2～3 mL 纯水 流尽（去除储存液中的20%乙醇），再加入 2～3 mL His结合缓冲液 流尽，重复平衡 2次。待液面降至树脂表面时，封闭柱下端，备用。📐 树脂用量参考：若目标蛋白表达量高（>5 mg/L），推荐每毫克目标蛋白使用 5～10 μL 树脂；不确定时可先按600 μL/10 mL上清试验。② 上样结合将离心后的蛋白上清液沿管壁小心加入柱中，自然重力流（流速约0.5～1 mL/min），收集流穿液（保留约50 μL用于电泳检测结合效率）。若样品体积过大，可分批次上样，待前一批次液面降至树脂表面后再加下一批。🔄 增强结合：为提高结合效率，可将上清与树脂在4℃旋转混合孵育1～2 h后再装柱，尤其在蛋白浓度较低时推荐此操作。③ 洗涤去杂待上清完全流尽后，加入 适量His结合缓冲液（通常每次加3～5 mL），充分洗涤树脂，去除未结合的杂蛋白。重复 3～5次，收集每次洗涤液。可用 Bradford法（取2 μL洗涤液加200 μL G250试剂）快速监测洗出液中蛋白含量，至蓝色极淡或无变化时停止洗涤。④ 梯度洗脱目的蛋白（咪唑浓度递增）依次配制含 50、100、150、200 mmol/L 咪唑 的His洗脱缓冲液（均含与结合缓冲液相同的Tris/NaCl/pH）。按浓度从低到高依次加入，每次加1 mL，用1.5 mL EP管收集各洗脱组分（每管收集1 mL）。实时检测蛋白浓度：取 2 μL 每管洗脱液，加入Bradford试剂（G250），若变蓝则表明蛋白含量较高，可继续收集该浓度组分；若颜色无变化，说明该浓度下无显著蛋白洗脱，可提前换用更高浓度咪唑。🧪 洗脱策略优化：若目标蛋白在较低咪唑浓度（如50 mM）下已大量洗脱，则无需使用更高浓度，可减少杂蛋白共洗脱。反之，若200 mM咪唑仍洗脱不彻底，可尝试 250 mM或500 mM 咪唑一步洗脱。⑤ 收集与保存将Bradford阳性管（含有目标蛋白）合并，取少量进行SDS‑PAGE，考马斯亮蓝染色后观察条带纯度及分子量是否相符。质量合格的蛋白溶液，加入甘油至终浓度10%（作为冻存保护剂），迅速置于 ‑80℃ 长期保存（分装成小份，避免反复冻融）。9. Ni柱再生与保存纯化完成后，立即洗涤树脂：His结合缓冲液 冲洗 2次（每次5 mL），去除残留咪唑；纯水冲洗 1次（5 mL），去除盐分；20%乙醇 冲洗 1次（5 mL），并充满20%乙醇，封闭柱两端，于 4℃ 保存。⏳ 柱寿命管理：若发现流速明显变慢或结合能力下降，可用 0.1 M NaOH 反向冲洗树脂（体积为柱床的2～3倍，室温静置30 min），再用大量结合缓冲液平衡至中性。一般Ni柱可重复使用5～10次。常用缓冲液配方（推荐）His结合缓冲液（Lysis/Wash Buffer），pH 8.050 mM Tris‑HCl300 mM NaCl（高盐有助于减少非特异性结合）10 mM 咪唑（低浓度咪唑抑制杂蛋白结合，但不影响His标签结合）调pH至8.0，0.22 μm过滤，4℃保存。临用前加入：1 mM PMSF、1 mM DTT（可选）。His洗脱缓冲液（不同咪唑浓度）50 mM Tris‑HCl，pH 8.0300 mM NaCl分别加入 50、100、150、200（或250）mM 咪唑0.22 μm过滤，4℃保存。  |
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