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科研战神来了新虫 (小有名气)
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一次成功！小鼠骨髓来源树突状细胞分离诱导干货分享
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一、实验前准备（提前1天完成） 1. 耗材与试剂清单枪头：1 mL、200 μL、10 μL 无菌滤芯枪头容器：试管架、50 mL / 15 mL 离心管、细胞培养皿（10 cm或6 cm） 工具：眼科剪、眼科镊（提前高压灭菌）、无菌70 μm细胞筛网、1 mL注射器（无针头）消毒剂：75%医用酒精、70%乙醇（配制后过滤除菌） 缓冲液：无菌PBS（pH 7.2~7.4，可自配或购买成品） 裂解液：红细胞裂解液（ACK裂解液，需无菌）细胞因子：重组小鼠GM-CSF、重组小鼠IL-4（浓度≥10 μg/mL，分装保存于-20℃） 完全培养基：RPMI-1640（含L-谷氨酰胺）+ 10% 胎牛血清（FBS，热灭活）+ 1% 青链霉素双抗（100 U/mL青霉素 + 100 μg/mL链霉素） 其他：冰盒、计时器、记号笔、封口膜2. 超净台准备将所有耗材（除冰盒外）放入超净工作台，开启紫外灯照射 30分钟，同时开启通风风机。照射结束后，关闭紫外灯，用75%酒精擦拭台面及双手，点燃酒精灯（若需要）。 将预冷的PBS、完全培养基、细胞因子等置于冰盒上备用（细胞因子避免反复冻融，使用前短暂离心）。 二、骨髓细胞分离 步骤1：小鼠处死与消毒取 6~8周龄 健康SPF级小鼠（雌雄不限，根据实验需求），采用颈椎脱臼法处死，确保快速、人道。将小鼠整体浸入 75%酒精 中，浸泡 5分钟，进行体表消毒。 步骤2：无菌取后肢骨超净台内操作，全程使用无菌器械。将小鼠俯卧于无菌培养皿上，用镊子提起髋关节上方皮肤，剪刀沿髋关节上缘剪开，小心分离后腿，暴露出股骨和胫骨。关键点：保持膝关节和踝关节完整不剪断，从髋臼处将整条后腿离断。用剪刀和镊子仔细剔除附着在骨骼上的肌肉、肌腱和结缔组织，尽量剥离干净，但切勿刮伤骨膜或骨质，以免造成污染或骨髓细胞流失。 步骤3：骨消毒与清洗将剥离干净的骨骼放入盛有 70%乙醇 的无菌培养皿中，浸泡 1分钟 进行表面消毒。取出骨骼，移至另一个盛有 无菌PBS 的培养皿中，用PBS漂洗 2次，每次轻轻晃动，去除残留酒精。 步骤4：骨髓腔冲洗（核心步骤）在无菌培养皿中倒入适量PBS（约5~8 mL），将股骨和胫骨置于其中。用剪刀剪去骨两端靠近关节处的骨骺（露出骨髓腔），注意剪口平整。取一支 1 mL注射器（不装针头），吸取PBS，将针头插入骨髓腔一端，缓慢推注PBS，从另一端冲出骨髓细胞，可见骨髓团块被冲入培养皿的PBS中。每根骨头反复冲洗 2~3次，直至骨髓腔完全变白（无红色残留），表明细胞已全部冲出。用移液管反复轻柔吹打骨髓液 10~15次，以解离细胞团块，获得单细胞悬液。 三、细胞纯化与计数 步骤5：过滤与初次离心将细胞悬液通过 70 μm无菌细胞筛网，过滤至一个 15 mL离心管 中，去除骨渣和未解离的组织碎片。配平后，1000 rpm（约200×g）离心 5分钟，室温。离心后弃去上清（可见白色或淡红色沉淀）。 步骤6：红细胞裂解向沉淀中加入 1 mL 红细胞裂解液，用移液枪轻轻吹打重悬，室温静置 5分钟 裂解红细胞（期间可轻摇一次）。裂解结束后，立即加入 5 mL PBS 中和裂解反应，混匀。再次 1000 rpm离心5分钟，弃上清（沉淀应为白色或淡黄色，若仍偏红可重复裂解一次，但一般不必要）。、 步骤7：洗涤与重悬加入 5 mL PBS 轻轻重悬沉淀，1000 rpm离心5分钟，弃上清，去除残余裂解液和细胞碎片。加入 1 mL 完全培养基（预温至37℃）重悬沉淀，再补加 4 mL 完全培养基，轻轻吹打混匀，即得到小鼠骨髓细胞悬液。 步骤8：细胞计数与铺板取10 μL细胞悬液，用台盼蓝染色（1:1稀释）后进行活细胞计数（使用血球计数板或自动计数器）。 用完全培养基调整细胞浓度至 1×10⁶ 个活细胞/mL。将细胞接种于培养皿中（例如10 cm皿约接种10 mL，即1×10⁷个细胞），并加入重组小鼠GM-CSF和IL-4，终浓度均为 20 ng/mL。轻轻摇匀，将培养皿放入 37℃、5% CO₂ 恒温培养箱中培养。此即为培养第0天（D0）。 四、换液与维持培养 （D2、D4）◆ 第2天（D2）——半量换液（去除悬浮淋巴细胞）取出培养皿，用无菌移液管将全部培养上清（含悬浮细胞）吸入至15 mL离心管中，1000 rpm离心5分钟。离心期间，向原培养皿中加入 预冷的PBS（约5 mL），轻轻晃动洗涤贴壁细胞，清洗2遍，以去除残留的悬浮细胞和死细胞碎片。离心结束后，可见管底有少量细胞沉淀（主要为悬浮的淋巴细胞），弃去沉淀（此沉淀不要回收）。 取离心后的上清液的一半量（约5 mL）加回原培养皿，再补充 5 mL 新鲜完全培养基（含GM-CSF和IL-4各20 ng/mL + 双抗），使培养皿内总体积恢复至约10 mL。放回培养箱继续培养。注意：D2时，树突状细胞前体及少量巨噬细胞已开始贴壁，而多数淋巴细胞仍悬浮，因此弃去沉淀可有效富集贴壁细胞。 ◆ 第4天（D4）——半量换液（保留悬浮的DC）D4时，部分树突状细胞已从贴壁状态变为悬浮或半悬浮，换液时须回收悬浮细胞。 操作：将培养皿内全部培养液（含悬浮细胞）吸入15 mL离心管，1000 rpm离心5分钟。离心后，弃去一半上清（约5 mL），用剩余的上清（约5 mL）轻轻重悬沉淀，然后将悬液全部加回原培养皿。再补充 5 mL 新鲜完全培养基（含GM-CSF、IL-4各20 ng/mL + 双抗），使总体系约10 mL。轻轻混匀，放回培养箱继续培养。 关键差异：D2换液丢弃沉淀，D4换液回收沉淀，因为D4时悬浮细胞中已富含未成熟的DC。 五、细胞收获与鉴定（D6~D8） 步骤9：收获细胞（低温操作）在 D6～D8 期间，根据实验需求选择收获时间（通常D6已可满足大部分实验，延长至D8可提高纯度）。将培养皿置于冰盒上，低温处理10分钟（此步骤可抑制DC活化，避免表型改变）。使用移液管轻柔吹打培养液表面，将悬浮细胞以及疏松贴壁的细胞（轻吹即可脱落）全部收集至离心管中。 注意：不要强力刮擦，因为强贴壁的细胞多为巨噬细胞，非目标DC。 步骤10：计数与下游实验将收集的细胞悬液计数（活细胞率一般>90%），根据实验设计进行后续刺激、抗原负载、流式染色或共培养。如需诱导成熟，可加入LPS（100 ng/mL）或TNF-α等刺激24~48小时。 步骤11：流式鉴定纯度（可选但推荐）取约1×10⁶个细胞，用荧光标记的抗小鼠CD11c抗体（如PE-anti-CD11c）进行流式细胞术检测。 典型结果：未成熟BMDC表现为CD11c⁺、MHC-II低表达，纯度通常可达 85%以上（与我们上次鉴定结果一致）。也可同时染色CD80、CD86、MHC-II评估成熟状态。 |
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