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毕赤酵母电转化实验
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求助求助！做毕赤酵母电转化一直不成功怎么办，有没有大佬指点指点提升成功率的细节，然后营养缺陷型培养基PAD有什么要求吗，转了六七次了，有时候培养基长一片薄薄的菌，有时候啥都不长，不知道是什么原因，求大神分析！ 发自小木虫手机客户端 |
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毕赤酵母电转主要包括质粒及其线性化，电转，感受态细胞，重组菌株培养。可以考虑以下几点：1.质粒。质粒是否有正确的序列，需正确插入目标基因，抗性基因完整；通过酶切线性化的质粒，线性化效率也是可以关注的点，可尝试提高线性化效率。2.使用质量好的感受态细胞。尝试更换酵母感受态。电转后立即放入冰遇冷的山梨醇溶液，速度要快，温度要冰。3.电转条件。使用合适的电转条件，包括电压、时间等。如是商用感受态，则咨询供应商最适电转条件；否则可尝试如下一般条件：电压1.5 kV,电阻200 Ω,电容25 μF,电击时间4～10 ms。4.培养基。使用新鲜配置的培养基以保证营养，确保培养基配置过程加料正确，PH合适，加入和质粒抗性基因匹配的抗性。培养温度，气体浓度正确。另外，不知道你提到的PAD培养基是不是指PDA(Potato Dextrose Agar)培养基，该培养基一般配方如下：马铃薯200克（去皮切块，煮汁取滤液）、葡萄糖20克、琼脂20克，加水定容到1升。 不想自己煮马铃薯，就买PDA干粉，按包装说明称量。培养基配制注意：配成溶液后高压灭菌：121℃ 15-20分钟（具体时间按你的灭菌锅和装量调整）； 灭菌后温度降到约50-60℃，倒平板或摆斜面；要加抗生素抑菌时，在50℃左右再加，加早了失效 ；冷凝后倒置放冰箱冷藏，避免冷凝水污染长杂菌。涂板培养时也应注意倒置操作防止长杂菌。最后，如果上述事项均尝试过了无效，而你的电转仪确实没坏，那么再考虑调整电压和电转时间，可以略微延长几秒时间，或设置几个电压和时间组合条件。 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2026-09-09 20:30:33
【答案】应助回帖
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毕赤酵母电转主要包括质粒及其线性化，电转，感受态细胞，重组菌株培养。可以考虑以下几点：1.质粒。质粒是否有正确的序列，需正确插入目标基因，抗性基因完整；通过酶切线性化的质粒，线性化效率也是可以关注的点，可尝试提高线性化效率。2.使用质量好的感受态细胞。尝试更换酵母感受态。电转后立即放入冰遇冷的山梨醇溶液，速度要快，温度要冰。3.电转条件。使用合适的电转条件，包括电压、时间等。如是商用感受态，则咨询供应商最适电转条件；否则可尝试如下一般条件：电压1.5 kV,电阻200 Ω,电容25 μF,电击时间4～10 ms。4.培养基。使用新鲜配置的培养基以保证营养，确保培养基配置过程加料正确，PH合适，加入和质粒抗性基因匹配的抗性。培养温度，气体浓度正确。另外，不知道你提到的PAD培养基是不是指PDA(Potato Dextrose Agar)培养基，该培养基一般配方如下：马铃薯200克（去皮切块，煮汁取滤液）、葡萄糖20克、琼脂20克，加水定容到1升。 不想自己煮马铃薯，就买PDA干粉，按包装说明称量。培养基配制注意：配成溶液后高压灭菌：121℃ 15-20分钟（具体时间按你的灭菌锅和装量调整）； 灭菌后温度降到约50-60℃，倒平板或摆斜面；要加抗生素抑菌时，在50℃左右再加，加早了失效 ；冷凝后倒置放冰箱冷藏，避免冷凝水污染长杂菌。涂板培养时也应注意倒置操作防止长杂菌。最后，如果上述事项均尝试过了无效，而你的电转仪确实没坏，那么再考虑调整电压和电转时间，可以略微延长几秒时间，或设置几个电压和时间组合条件。 |
3楼2026-09-09 20:42:38
