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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞活性氧 ROS 检测实操指南｜酶标仪定量 / 荧光成像双方案全覆盖
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细胞活性氧 ROS 检测 · 操作步骤 🧪1️⃣ 接种细胞将细胞接种到96孔板中（建议每孔约3000个细胞，具体数量根据细胞类型调整），置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。⚠️ 接种前观察细胞状态，确保细胞状态良好后再进行后续处理（加药/转染）。 2️⃣ 细胞处理待细胞密度达到60%-70% 时，进行转染或加药处理细胞。💡 处理时间根据实验设计而定，一般药物处理时间可为30 min至数小时不等：刺激时间较短（通常2小时以内）的实验，建议先装载探针，再刺激细胞。刺激时间较长（通常6小时以上）的实验，建议先刺激细胞，再装载探针。3️⃣ 稀释探针按照 1:500 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为 10 μmol/L。💡 小贴士：DCFH-DA母液一般用DMSO配制，-20℃避光保存，实验前取出平衡至室温。若阴性对照组荧光背景过强，可尝试按1:2000-1:5000稀释（终浓度2-5 μM），或适当缩短探针装载时间。无血清培养基需提前预热至37℃，用于稀释探针（避免血清中酯酶干扰）。4️⃣ 装载探针去除原细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA（全程避光操作⚠️），加入量以能完全覆盖细胞层为宜：96孔板：每孔 50 μL6孔板：每孔 1 mL5️⃣ 孵育将细胞置于 37℃ 细胞培养箱内避光孵育 20 分钟。💡 孵育期间可每隔3-5分钟轻轻摇晃培养板，使探针与细胞充分接触。6️⃣ 清洗细胞用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。⚠️ 这一步非常关键！ 残余探针未洗净会导致背景荧光过高，影响结果的准确性。7️⃣ 加液待测清洗完成后，每孔加入 50 μL PBS 进行后续检测。8️⃣ 检测🔬 方法一：多功能酶标仪检测使用 488 nm 激发波长，525 nm 发射波长 进行检测。💡 DCF的荧光光谱与FITC非常相似，可直接使用FITC的参数设置进行检测。📷 方法二：荧光显微镜拍照可直接在荧光显微镜下观察并拍照记录。💡 若扫描第一遍时荧光信号较弱，可在同一位置连续扫描2-3次，使荧光分子充分激发。拍照时注意调整成像参数（激光强度、增益值等），避免图像过曝。 注意事项 & 常见问题 ⚠️🧪 关于阳性对照阳性对照（如Rosup）一般使用浓度为 100 μM（推荐范围100-400 μM，具体依细胞类型而定）。阳性对照仅用于阳性对照孔，并非每孔都需加入。通常刺激后 0.5-4小时 可观察到显著的活性氧水平升高。对于刺激时间较短的实验：先装载探针，再与阳性对照一同放入培养箱孵育。对于刺激时间较长的实验：先用阳性对照或药物刺激细胞，再进行探针装载。📊 关于数据分析实验数据可用 Excel 分析荧光强度，计算各组的平均荧光强度并进行统计学比较。荧光显微镜拍照时，建议每组设置5个重复孔，每孔随机选取多个视野拍照。🧬 关于核染（Hoechst）若需进行细胞核染色，应先进行 Hoechst 染色，染色完成后再继续进行 ROS 检测。  |
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