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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞传代总污染、状态差？这份完整实验 Protocol 手把手教你
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细胞传代，简言之，就是将体外培养的细胞分瓶继代培养。它的核心意义在于 维持细胞的活力与增殖能力，避免因营养枯竭、代谢废物堆积而引发细胞衰老甚至死亡。无论你是初入细胞房的新手，还是想梳理操作细节的老手，这篇基于实战的完整流程都值得收藏。 一、实验准备：细节决定成败1. 操作台（超净台）准备开启超净台紫外灯，照射 30 分钟，彻底灭菌。紫外灭菌结束后，关闭紫外灯，打开风机，通风 10 分钟，排净残余臭氧。用 75% 酒精棉球 仔细擦拭台面，由内向外，不留死角。点燃酒精灯（若使用），在火焰周围操作可形成局部无菌区。 2. 试剂准备（提前从 4℃ 冰箱取出）完全培养基（配方：基础培养基 + 10% FBS + 1% 双抗）胰酶（0.25% 或根据细胞类型调整）无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）将上述试剂放入 37℃ 水浴锅 预热，务必拧松瓶盖 以防气压过大，预热时间不宜超过 30 分钟。3. 耗材准备15 mL 无菌离心管（若干）6 cm 或 10 cm 无菌培养皿（根据实验需求）无菌移液枪头、移液管记号笔、酒精喷壶 配制总量：500 mL；基础培养基：445 mL；FBS (10%)：50 mL；双抗(1%)：5mL 配制总量：50 mL；基础培养基：44.5 mL；FBS (10%)：5mL；双抗(1%)：0.5mL 将各组分按量加入瓶内，轻轻摇晃容器 5～10 次，混合均匀。⚠️ 严禁剧烈震荡，以免血清蛋白变性，影响细胞生长。用记号笔在瓶壁标注 “完全培养基”+ 配制日期，并签名。配制好的完培可于 4℃ 保存，使用前再次预热。 步骤 2：细胞消化与传代（核心操作）（1）观察细胞状态双手喷酒精后，从培养箱取出细胞培养皿。在倒置显微镜下观察细胞密度：当细胞生长至 80%～90% 汇合度 时，即为最佳传代时机。👉 判定技巧：随机选一个视野，若该视野下 80%～90% 的区域被细胞覆盖，即可传代。（2）清洗细胞（去除残留血清和代谢物）皿壁喷酒精后移入超净台。用移液枪沿皿壁轻柔吸除旧培养基，枪头不要触碰细胞面。更换新枪头，沿壁加入 2 mL PBS（6 cm 皿为例），轻轻摇晃皿 10 次左右，洗去残余培养基。吸除 PBS，重复洗涤 1 次（共 2 次）。⚡ 关键点：动作要轻且快，避免细胞长时间暴露于无液体状态，以防干涸损伤。（3）胰酶消化沿皿中央加入 1 mL 胰酶（6 cm 皿；10 cm 皿可用 2 mL），以刚好覆盖细胞表面为准。盖上皿盖，轻轻晃动使胰酶铺匀。放入培养箱，37℃ 消化约 2 分钟（具体时间因细胞类型而异）。取出后在显微镜下观察：细胞形态变圆、皱缩，且轻轻晃动培养皿可见细胞层流动，即消化完全。⏱ 等待间隙：可提前准备好 15 mL 离心管，置于管架上备用。（4）终止消化皿壁喷酒精后拿入超净台。用移液枪吸取皿内胰酶，轻柔吹打皿底壁数次，帮助未脱落细胞脱离（避免吹出大量气泡）。观察到皿底无白色膜状残留即可，无需过度吹打。立即加入 3 mL 完全培养基（6 cm 皿）终止消化。用移液枪反复吹打皿底壁，使全部细胞脱落成单细胞悬液。💡 吹打技巧：移液枪调至 “一档吸、一档打” 模式，减少气泡产生，保护细胞免受剪切力损伤。（5）离心收集细胞将细胞悬液全部转移至 15 mL 离心管 中。配平后，1200 rpm 离心 5 分钟，可见管底白色细胞沉淀。⏳ 离心期间：准备传代用的新培养皿——在皿盖上标注：细胞名称、代数、传代日期、操作人姓名。加入 5 mL 完全培养基（6 cm 皿）或 9 mL（10 cm 皿），待用。（6）重悬与传代（按比例分瓶）离心结束后，弃去上清液（注意不要吸走沉淀）。向沉淀中加入 2 mL 完全培养基，用移液枪反复吹打约 20 次，制成均匀单细胞悬液。传代比例选择：根据细胞密度和生长特性，常用 1:3、1:4 或 1:5。例：若按 1:4 传代，即取 0.5 mL 细胞悬液（2 mL 悬液中的 1/4），滴入已备好的新培养皿中。采用 “8 字法”或“十字法” 轻轻摇晃培养皿约 10 次，使细胞均匀分布。于倒置显微镜下观察——此时可见亮晶晶的单个细胞，分布均匀即为成功。皿壁喷酒精后，放入 37℃、5% CO₂ 恒温培养箱 中静置培养。 、注意事项（经验之谈）🧤 枪头使用守则：一旦枪头接触到任何非目标区域（如培养皿外壁、管壁等），立即更换新枪头，切勿再伸入培养皿或试剂瓶，严防污染。🧴 液体操作防污染：吸除废液时，先将枪头内液体完全排空，再伸入皿内操作，避免液体回溅污染枪体。⏰ 时间把控：整个消化和吹打过程尽量控制在 5～8 分钟内，减少细胞在室温下的损伤。🌡️ 试剂预热：所有接触细胞的液体（PBS、胰酶、完培）必须提前预热至 37℃，冷刺激会诱导细胞收缩，影响消化效果。📝 记录习惯：每次传代务必详细记录日期、代数、操作人，便于追溯细胞状态和老化情况。 |
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