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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
细胞 ROS 荧光成像实拍｜终于拍出清晰度拉满的优质结果
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一、细胞铺板（密度是关键）板型：96孔板，黑边透明底，经细胞表面吸附处理（推荐Corning #3603或同类）。铺板密度：2～3 × 10⁴ 个/孔（具体视细胞增殖速度微调，以贴壁后24h融合度达70%～80%为准）。培养基：含血清完全培养基，每孔 100 μL，边缘孔可加PBS避免边缘效应。铺板手法：十字摇匀法，避免孔间细胞分布不均。 二、贴壁培养（给细胞“安家”）37℃，5% CO₂培养箱中静置培养 24 h。确认融合度达 70%～80%（过密会导致ROS基础值偏高，过疏则信号太弱）。观察形态是否舒展，边缘清晰，无漂浮死细胞团。 三、药物暴露处理（加药要稳）工作浓度：根据你的药物预实验确定（此处请填写你的最终浓度，如 X μM）。每孔体积：100 μL（用完全培养基或无血清培养基稀释，视药物性质而定）。复孔设计：4个复孔/组，同时设 空白对照（仅培养基）、溶剂对照（如DMSO，控制终浓度≤0.1%）。加药工具：排枪 + 2个枪头同时吸打，减少孔间加液时间差，保证暴露时间一致。暴露时长：24 h（若为时间梯度，可另设 6h / 12h / 24h 点）。 四、探针装载前准备（弃药 + 清洗）暴露结束后，迅速弃去含药培养基（用真空泵或排枪吸净，注意不要刮到底部细胞）。PBS 清洗 1 次，每孔 100 μL，轻柔拍板弃去，去除残留药物和血清干扰。 五、ROS探针配制与孵育（避光！避光！避光！）探针选择：此处以 DCFH-DA（2',7'-二氯荧光素二乙酸酯） 为例，若你用其他探针（如DHE、MitoSOX），比例需相应调整。配制体积：按 60 个孔 计算，配制 6 mL 工作液（多配10%防止挂壁损耗）。稀释比例：无血清培养基 + 探针原液 = 1 : 2000 → 例：6 mL 无血清培养基 + 3 μL 探针原液（充分混匀，现配现用）。装载操作：每孔加入 100 μL 探针工作液，4个复孔操作一致。孵育条件：37℃培养箱中 避光孵育 20 min（时间过长易产生非特异性水解，过短则负载不足）。 六、探针后清洗（去除游离染料）孵育结束后，吸去探针工作液。PBS 清洗 1～2 次，每孔 100 μL，轻柔洗去未进入细胞的探针残留。最后一次清洗后，每孔加入 100 μL 新鲜 PBS，保持液面覆盖，准备上机。 七、荧光信号读取（拍照 & 酶标仪）仪器设置：酶标仪（如BioTek、Tecan）读取荧光强度：激发波长 485 nm，发射波长 525 nm。读板前 不盖板盖，不摇板（摇板会引入液面波动噪声）。读取模式：底部荧光（若为透底黑板）。成像拍照（若配备活细胞成像系统）：明场 + 荧光双通道拍摄，同一视野叠加，便于观察细胞形态与ROS信号定位。曝光时间、增益保持一致，组间定量对比。 八、阳性对照（必须做的质控！）ROS-Up 母液（通常为含过氧化氢或Rosup诱导剂）按 1 : 1000 稀释： → 1 mL PBS + 1 μL ROS-Up。添加时机：在 探针染色前 30 min 内 加入阳性对照孔（即与药物暴露同步，或替换原药物处理）。后续操作 完全一致：弃液 → PBS洗 → 探针装载 → 洗涤 → 读值。阳性对照荧光强度应显著高于空白组，否则说明探针失效或操作有误。 九、数据归一化与记录要点建议以 空白对照孔 荧光值为基线，计算 相对ROS水平（% of Control）。每板至少保留 3个空白孔（无细胞，仅PBS）用于扣除背景。记录 批次、细胞代数、探针货号、稀释时间，便于后续回溯。 实验避坑小贴士（都是血泪教训）探针避光：从配制到孵育全程锡纸包裹或关灯，荧光淬灭不可逆。排枪使用：枪头务必预润洗一次，保证每孔实际体积均一。清洗次数：探针后清洗不超过2次，过多会洗脱胞内已标记的染料。读板顺序：先读板再拍照，或先拍照再读板，不可频繁移动板子影响焦点。 |
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