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源井点突变细胞赋能研究：揭秘SF3B1突变如何通过circATP9B抑制DNA修复
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SF3B1 是骨髓增生异常综合征、血液系统恶性肿瘤及多种实体瘤中高频发生突变的 RNA 剪接因子。已有研究表明，SF3B1 突变可导致同源重组（HR）修复功能缺陷，使肿瘤细胞对 PARP 抑制剂更加敏感，但其具体分子机制仍未完全阐明。 近日，吉林大学中日联谊医院钱睿团队在《Cell Death & Disease》发表最新研究成果。研究发现，SF3B1 热点突变 K700E 能够显著上调环状 RNA circATP9B 的表达，而 circATP9B 可促进 MYH9 的泛素化降解，进而破坏核肌动蛋白网络的组装，阻碍 DNA 双链断裂位点的迁移与聚集，最终抑制同源重组修复过程。进一步的细胞和动物实验表明，敲低 circATP9B 或恢复 MYH9 表达均可逆转 SF3B1 突变引起的 DNA 修复缺陷，为 SF3B1 突变型肿瘤应用 PARP 抑制剂提供了新的分子机制解释和理论依据。 值得一提的是，该研究所使用的关键实验模型——K562 SF3B1-K700E 点突变细胞株，由源井生物提供，为相关机制研究提供了重要的细胞工具支持。 研究背景 SF3B1 是 RNA 剪接体 U2 snRNP 的核心组成因子，主要负责识别 pre-mRNA 内含子 3' 剪接位点，并参与 RNA 剪接过程。在多种恶性肿瘤中，SF3B1 均存在较高频率的突变，这类突变会导致 pre-mRNA 内含子 3' 端异常选择性剪接事件显著增加。已有大量研究证实，由 SF3B1 突变引发的异常剪接可影响多种癌症相关关键基因的表达，进而促进肿瘤的发生与发展。此外，携带 SF3B1 突变的细胞通常表现出 DNA 同源重组修复（HR）功能缺陷，但其导致 DNA 损伤修复异常的具体分子机制仍有待进一步阐明。 Circular RNA(circRNA)作为一种呈共价闭合环状结构的RNA分子，主要通过下游内含子的5’剪接位点与上游内含子的3’剪接位点之间的反向剪接生成，而反向剪接的完成依赖于包括U2 snRNP在内的RNA剪接体复合体。SF3B1表达降低导致细胞中circRNA的表达发生改变。有研究显示携带有SF3B1突变的骨髓异常增生综合征病人样本中有些circRNA的表达也发生改变。然而，关于SF3B1突变如何干扰circRNA表达的系统性研究尚未见报道。 主要结果 为进一步解析 SF3B1 对 circRNA 表达的调控机制，研究团队对携带 SF3B1 突变的细胞进行了高通量测序分析。结果显示，在多种细胞系中，SF3B1 突变均可引起 circRNA 表达谱发生变化，其中多数差异表达的 circRNA 具有明显的细胞系特异性。然而，值得注意的是，无论在哪种细胞系中，SF3B1 突变均能显著上调 circATP9B 的表达水平。 随后，研究人员进一步分析了既往公开测序数据库，发现 circATP9B 在携带 SF3B1 突变的骨髓增生异常综合征患者样本中同样呈现高表达。进一步实验表明，SF3B1 突变并不会影响 ATP9B pre-mRNA 和成熟 mRNA 的表达水平，说明其并非通过调控基因转录，而是通过促进反向剪接过程增强 circATP9B 的生成。此外，荧光原位杂交（FISH）等实验结果显示，circATP9B 主要定位于细胞质中。 为进一步阐明 circATP9B 的生物学功能，研究团队利用质谱分析筛选其结合蛋白，结果发现 circATP9B 与 MYH9 存在显著相互作用。随后，研究人员进一步评估了 circATP9B 对 MYH9 表达的影响。结果显示，过表达 circATP9B 可明显降低 MYH9 蛋白水平，但对 MYH9 mRNA 的表达没有显著影响，提示 circATP9B 并非调控 MYH9 的转录，而是在转录后水平影响其蛋白表达。 进一步机制研究发现，circATP9B 过表达可降低 MYH9 蛋白稳定性，并显著增强其泛素化修饰水平，表明 circATP9B 能够通过促进 MYH9 的泛素化降解，负向调控 MYH9 蛋白表达。 MYH9 是非肌肉肌球蛋白家族的重要成员，主要通过参与肌动蛋白丝的形成，维持细胞形态及运动功能。近年来研究发现，当细胞发生 DNA 双链断裂（DSBs）时，细胞核内会形成肌动蛋白丝，并促进 DNA 损伤位点的迁移与聚集，从而提高 DNA 损伤修复的效率和准确性。由此，作者探究了MYH9在DNA损伤修复和核肌动蛋白丝的形成中的作用。在经放射线处理诱导DNA损伤的细胞中，敲低MYH9抑制DNA损伤位点的修复，而且敲低MYH9的细胞对DNA损伤修复抑制剂Olaparib更敏感，说明MYH9的敲低造成DNA损伤修复的缺陷。活细胞成像显示敲低MYH9导致在DNA发生损伤时核肌动蛋白丝的组装受到阻碍， DSBs的移动和聚集能力也受到明显抑制，说明MYH9通过参与细胞核中肌动蛋白丝的组装调节DSBs的移动和聚集。这一系列实验结果表明MYH9通过参与核肌动蛋白丝的组装促进DNA损伤修复。 为进一步验证 circATP9B 在 DNA 损伤修复中的作用，研究团队开展了一系列功能实验。结果显示，过表达 circATP9B 可抑制核肌动蛋白丝的组装，并削弱 DNA 损伤修复能力；而在此基础上恢复 MYH9 的表达后，这种抑制作用得到明显逆转，说明 circATP9B 主要通过促进 MYH9 蛋白降解，进而抑制 DNA 损伤修复过程。 在体内实验中，裸鼠移植瘤模型进一步验证了这一结论。研究发现，Olaparib 处理可显著抑制过表达 circATP9B 肿瘤细胞的生长，进一步证明 circATP9B 会削弱 DNA 损伤修复能力，从而增强肿瘤细胞对 PARP 抑制剂的敏感性。 此外，研究人员在携带 SF3B1 突变的细胞中敲低 circATP9B 后发现，SF3B1 突变对核肌动蛋白丝组装的抑制作用得到明显缓解，DNA 双链断裂位点（DSBs）的迁移与聚集能力也随之恢复，受损 DNA 的修复效率进一步提高。这些结果表明，circATP9B 是 SF3B1 突变抑制 DNA 损伤修复的重要介导分子，在 SF3B1 突变导致的 DNA 修复缺陷中发挥关键作用。 文章小结 本研究综合运用多组学筛选、分子互作分析、活细胞动态示踪及动物模型等研究手段，系统揭示了 SF3B1-K700E 热点突变介导 DNA 损伤修复缺陷的分子机制。研究发现，SF3B1-K700E 突变可显著上调 circATP9B 的表达，而 circATP9B 能够结合 MYH9 并促进其泛素化降解。MYH9 的缺失进一步破坏核肌动蛋白网络的组装，阻碍异染色质 DNA 双链断裂（DSBs）的迁移与聚集，抑制同源重组修复（HR）过程，最终导致基因组不稳定性增加。研究揭示了SF3B1 突变驱动肿瘤进展的非经典 circRNA 介导通路，为携带 SF3B1 突变恶性肿瘤的靶向治疗提供新思路。 源井生物提供的支持 在该研究中，源井生物基因点突变细胞服务提供的SF3B1突变的K562细胞模型为揭示 SF3B1 突变驱动肿瘤进展的非经典 circRNA 介导通路发挥了重要作用。 |
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