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义翘神州

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[资源] 冰冻切片有断裂伪影？试试麻省总医院用易拉罐改良的这套异戊烷-液氮预冷法

在冰冻切片操作时，可不可以将组织直接放入-20℃或-80℃冰箱中进行冷冻呢？我们是不建议这样操作的，为什么呢？

冰冻切片操作的第一挑战就是如何防止冰晶形成和保持组织形态完整性。新鲜的组织含有大量游离水与结合水，冰箱虽然能够提供低温环境，但降温过程缓慢，水分子会聚集形成大冰晶，挤压、破坏细胞骨架与细胞器结构，会出现明显的空泡、撕裂、抗原位点损伤。

一、冰晶对冰冻切片的影响

冰晶是组织或细胞内水分在冷冻过程中凝结形成的大晶体，会造成组织变形、细胞破裂，出现空泡样染色结果。

冰冻速度慢是冰晶形成的主要原因。冷冻时细胞外液先结冰，细胞膜减缓胞内液体结冰。如果冷冻速率慢就会造成水分子外渗形成大冰晶，如仅采用速冻台冰冻容易形成大量冰晶。

组织本身含水量高也会使冰晶形成几率显著提升。肝、肾、脑、甲状腺、淋巴结等组织水分含量丰富，处理不规范会形成大冰晶。组织块体积大（超过5mm）、oct包埋过厚、组织反复冻融等操作细节的失误，也会促进冰晶形成。（注：oct包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，具有支撑组织、减少切片皱折及碎裂的作用。）

二、速冻：减少冰晶形成

组织厚度及操作环境等因素将会影响冰晶的形成。样本体积尽量小一些，控制在1.5cm×1.5cm×0.3cm，厚度不应超过0.4cm。冰冻切片机需要提前开机预冷，温度降至-20℃～－25℃，一般将冷冻箱温度降至－25℃，冷冻头温度降至－30℃。

组织样本在处理过程中尽量避开水源。取材时器械和台面保持干燥。若组织内含水或血液时应用干的纱布活滤纸把水分吸干后再冷冻，不用生理盐水浸泡或用湿纱布包裹组织。

骤降速冻是减少冰晶形成的关键操作。根据冷冻介质的种类不同，冰冻切片分为oct包埋后干冰速冻、液氮蒸汽速冻和异戊烷预冷速冻。骨骼肌、脑组织等通常选择异戊烷-液氮预冷法。

在操作时，新鲜组织或包埋块不能直接浸入液氮中。因为这样操作可能会在组织表面瞬间形成气体隔层，阻碍降温，且温差较大会造成组织块炸裂或形成气泡。可以选择液氮蒸汽或异戊烷-液氮预冷法进行冰冻。

预冷的异戊烷依然保持液态，热传导效率高于液氮蒸汽，可以实现均匀快速地降温，减少冰晶形成。在不锈钢烧杯内加入约300ml的异戊烷，将其浸入液氮，没入异戊烷高度的1/3。当烧杯底部出现一层固态冰壳时，将组织包埋模具的底部浸入其中。

组织浸泡冷冻的时长由样品尺寸决定。体积越大，所需冷冻时间越长。膈肌、趾长伸肌（edl）这类小型组织时长为6-12s。小鼠比目鱼肌体积更小，建议控制在6s内。小型骨骼肌的比表面积较大，容易出现冷冻断裂伪影，对冷冻条件的要求更加苛刻。

三、改良异戊烷-液氮预冷法

麻省总医院的研究团队于2025年在bio-protocol发表一篇实验技术类论文，针对小鼠微小骨骼肌冷冻包埋存在的冷冻断裂伪影问题，建立了一套可重复的改良冷冻方案。

常规异戊烷-液氮预冷法用大号铝罐加入300 ml异戊烷，将其放入盛有液氮的泡沫箱中，使铝罐浸入液氮，没入高度为异戊烷的1/3（即100 ml的液面位置）。罐底出现白色冻结层时，温度降至-120℃，将oct包埋模具放入异戊烷中。冷冻至oct完全变白，转移至干冰静置5-10分钟。

改良法使异戊烷完全固态，用小号铝罐添加30 ml异戊烷，浸入液氮完全冻实，温度达到-160℃，然后将包埋好肌肉的oct模具平放在固态异戊烷表面。oct完全变白，转移至干冰静置15-20分钟。

通过he染色观察切片形态。统计结果发现：传统液态组比目鱼肌平均断裂率为56.04%，而改良固态组平均断裂率仅为3.88%，两组损伤程度差异显著。且传统冷冻会造成组织边缘大面积破损和肌纤维破裂。

改良异戊烷冷冻法（源自文章：cryopreservation method for preventing freeze-fracture of small muscle samples）

四、新鲜组织处理与冰冻切片操作流程

01样品前处理

新鲜组织离体后，尽量在短时间内完成速冻，避免蛋白质降解和溶酶体释放。取材后要立即用无尘吸水纸彻底吸干组织表面多余的液体或血液。这是实操中容易被忽略的一步，也是影响结果的一步。组织表面如有游离水，速冻时会形成大硬块，切片时易脱落或造成整张切片破裂。

在冷冻模具或自制铝箔托中底部注入少量oct包埋剂。用镊子夹住组织，在立体解剖镜或肉眼下精准调整好待切面的朝向。待切面朝向模具底面。为切出肌肉的横断面，骨骼肌应使肌纤维长轴垂直于底面。随后注满oct包埋整块组织。操作时不能产生气泡，可用镊子将组织周围的气泡排除。注意在注入过程中不要造成组织块移动。

02速冻操作

根据上文的介绍，可以将速冻方法归为液氮冷冻法和非液氮冷冻法。

1）液氮蒸汽法：用长镊子夹住模具，悬浮在液氮液面上方的冷气中进行。不能直接浸入液氮中，可能会导致组织块炸裂。

2）异戊烷-液氮预冷法：在不锈钢烧杯内加入约5厘米高度的异戊烷，用镊子将烧杯放入液氮罐中，使杯底接触液氮液面即可。在这里分享一个操作小技巧，为防止烧杯掉落到液氮罐中，可以用一个泡沫盒子装满液氮，操作时将装有异戊烷的烧杯放入其中。

用长柄镊将包埋模具放入异戊烷中，注意不要使模具倾斜，确保组织不会被移动。包埋剂会凝固成白色固态，静置1min可使整个组织被充分冻结。将冷冻组织移至干冰容器中保存5-10min，以去除模具表面的异戊烷。冷冻组织可放在-80℃冰箱中保存。

3）干冰法（非液氮）：将干冰放入保温杯中，使其表面平整，然后将包埋模具平放在干冰上。还可用干冰-丙酮（乙醇）法：取150-200ml 丙酮乙醇混合液至保温杯中，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰时不冒泡。此时温度可达-70℃，可直接将模具放入进行冷冻。也有实验室在此基础上，用100ml的小烧杯装上50ml异戊烷，然后将模具置于小烧杯中，可减少冰晶的形成。

03精准控温切片

储存于-80℃冰箱的包埋块在切片前需要提前移至冷冻切片机箱体内进行15-30min的温度平衡。不同类型和大小的组织块需要的冰冻温度会有差异，如乳腺、神经髓鞘这类富含脂质的组织，需要更低的温度（-20℃～-25℃），脂质需要充分硬化，温度过高可能会使切片软塌、无法成型。肌肉、肝、肾等实质纤维丰富的组织，适宜温度在-10℃～-20℃。脑、眼球等组织对温度精度要求更高，通常在-20℃左右进行微调。