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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
如何寻找已知基因的下游靶基因
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做分子机制研究的小伙伴，大概率都遇到过这个难题：手握一个已知核心基因，却完全不知道它调控哪些下游基因、参与什么通路。无论是转录因子、功能蛋白还是非编码RNA，想要阐明分子机制，锁定下游靶基因、构建完整调控网络都是关键。今天这篇干货，手把手教大家一套完整流程。 01 什么是基因下游靶基因简单来说，当前已知上游基因发生表达变化后，随之产生表达改变、且受其特异性调控的基因，即为该基因的下游靶基因。那么在研究过程中，我们需要明确我们这个已知基因的功能类型，不同类型基因的下游属性、调控方式、筛选方法不同。比如以下三类：1.转录因子类基因转录因子可直接结合靶基因的启动子、增强子等调控区域，从转录层面直接激活或抑制靶基因表达，特异性强，是机制研究中最经典的靶向调控模式。具体研究方法可见如何寻找转录因子的下游靶基因一文 2. 信号通路分子（激酶/受体/衔接蛋白等）这种信号通路分子不直接调控基因转录，可能通过磷酸化修饰、蛋白互作、表观遗传调控、mRNA稳定性调节等多种机制，直接或间接影响下游靶基因表达。信号通路类分子靶基因的筛选流程1. 生信初筛：可以通过STRING、KEGG、GO数据库，查询该通路分子所属信号通路，筛选通路内上下游关联蛋白、核心富集基因2. 进一步筛选：干预通路分子表达（过表达/敲低），开展RNA-seq+IP-MS联合分析，一方面筛选转录水平差异基因，一方面筛选互作下游蛋白；3. 实验验证：如WB检测通路关键蛋白的磷酸化水平、总蛋白表达变化，验证通路激活/抑制状态；qPCR验证下游靶基因表达趋势；4. 功能验证：通路阻断/激活干预+回补实验，确认该分子通过调控下游通路及靶基因，介导生物学功能。 3.非编码RNA（miRNA/lncRNA/circRNA）可通过多种机制调控靶基因，包括mRNA稳定性、翻译效率、转录激活/抑制、蛋白功能调控等。下游靶基因筛选流程：1. 生信初筛：miRNA用TargetScan、miRDB预测下游靶基因；lncRNA/circRNA用StarBase、LncTar数据库，筛选互补配对的靶向分子及下游基因；2. 进一步筛选：干预非编码RNA表达，转录组测序筛选差异表达基因，与生信预测靶基因取交集，缩小候选范围；3. 实验验证：核心采用验证非编码RNA与靶基因mRNA的靶向结合及转录后调控功能；通过RIP、RNA pull-down实验验证RNA-蛋白、RNA-RNA互作关系；qPCR验证下游基因表达调控关系；4. 功能验证：ceRNA通路回补实验，验证lncRNA/circRNA→miRNA→下游靶基因的调控轴；那么根据不同功能类型的已知基因，我们的研究思路：先根据自身基因的功能属性定调控类型，再针对性初筛候选靶基因，剔除假阳性后开展实验验证。 02 研究的开展思路 第一阶段是需要先定位到下游靶基因这里可以通过生物信息学预测或者高通量测序筛选来实现。对于生物信息学预测，比如我们前面提到的转录因子，就可以通过JASPAR、TRANSFAC等查询转录因子结合基序，扫描基因组中含对应基序的基因，预测潜在下游靶标。最常用的方法是高通量测序筛选，构建对照组+实验组（核心基因过表达/敲低/敲除细胞/组织模型），保证单一变量。RNA-seq转录组测序（最通用、全覆盖）对比两组样本的mRNA表达差异，显著上调/下调的差异基因，即为核心基因调控的下游候选靶基因，涵盖直接、间接靶标。后续搭配GO/KEGG富集分析，可快速锁定核心调控通路，聚焦关键下游基因。多组学联合ChIP-seq+RNA-seq：取交集后获得高可信度候选直接靶基因，需进一步通过功能实验验证调控关系ATAC-seq+RNA-seq：结合染色质开放区域变化与表达差异，筛选核心基因调控的功能性下游靶标IP-MS+RNA-seq：针对功能蛋白，通过蛋白互作+转录差异，锁定下游调控分子与通路。 第二阶段是对筛选得到的下游靶基因的分子实验验证1. 表达水平验证（基础必做）通过qPCR、Western blot检测：核心基因过表达/敲低后，候选下游基因的mRNA、蛋白表达是否发生对应变化。2. 直接结合验证（转录因子核心实验）ChIP-qPCR：在体内细胞中，验证核心转录因子是否直接结合靶基因的启动子区域双荧光素酶报告基因实验：体外验证转录因子与靶基因启动子的靶向结合及转录调控活性3. 功能回补验证Rescue策略：敲低核心基因导致表型异常，同时过表达下游靶基因，观察表型是否rescue；阻断策略：过表达核心基因导致表型改变，同时敲低下游靶基因，观察表型是否被阻断；特异性对照：过表达下游靶基因的功能缺失突变体，验证rescue是否依赖特定功能域 |
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