| 查看: 696 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
转录因子找不到下游靶基因？全套验证思路一次性讲清
|
|
解析转录因子（TF）与下游靶基因的调控关系，是转录调控、信号通路、疾病机制研究的核心。很多科研人卡在 “找不到候选基因、验证证据不足、分不清实验优先级”。今天我们就用通俗易懂的语言概括主流研究方法。当我们现在需要研究的分子是个转录因子的话，那么我们可以通过以下几个步骤进行逐级验证。 第一步：生物信息学预测转录因子主要结合靶基因启动子、增强子等调控区域，每种 TF 都有专属的 DNA 结合基序（Motif）。我们可以通过两大方向筛选：① 预测 TF 结合位点；② 检索前人已验证的 TF - 靶基因关系。这里可以使用到的数据库包括：结合位点预测：JASPAR、HOCOMOCO：全球通用 TF 基序数据库。截取基因转录起始位点（TSS）上游 1500~2000 bp启动子序列，扫描匹配 TF 结合位点，分数越高，结合可能性越大。 已验证靶基因查询：TRRUST、ChIPBase：整合海量已发表的 ChIP 数据、文献结果，可直接查询该转录因子已被证实的下游靶基因，可信度更高。需要注意的是生信预测仅作为候选参考，存在一定假阳性，绝对不能单独作为实验结论。所有筛选出的候选基因，都必须通过后续分子实验进一步验证。 第二步：实验验证 —— 体内 + 体外双重验证假设我们通过生信或者其他手段明确了候选基因后，接下来就要进入实验验证环节。这一部分分为体内结合验证、转录功能验证、体外互作验证，涉及的实验手段包括：ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验、酵母单杂交、DNA Pull-down等。 体内研究方法：①ChIP-qPCR：体内蛋白 - DNA 结合金标准原理：ChIP（Chromatin Immunoprecipitation，染色质免疫共沉淀）是目前研究体内蛋白质与DNA特异性结合的核心经典技术，它主要是用来回答谁在调控谁的基因。核心作用就是：精准“抓捕”细胞内真实结合在DNA上的目标蛋白，同时富集对应的DNA片段，帮我们验证基因调控机制。比如我们想知道转录因子A是否结合了基因B的启动子，那么我们就可以把细胞进行交联，然后超声或者酶解打碎，用A的抗体去做IP，然后把拉下来的这些DNA进行纯化，随后可通过qPCR检测特定靶基因启动子区域的富集程度（ChIP-qPCR），或进行高通量测序鉴定全基因组结合位点（ChIP-seq）。②双荧光素酶报告实验：验证转录调控功能原理：双荧光素酶报告系统利用荧光素酶作为报告分子、海肾荧光素酶为内参。将靶基因启动子序列与萤火虫荧光素酶基因融合构建报告载体，与转录因子表达质粒、海肾内参载体共转染细胞。转录因子可结合启动子区域并调控下游荧光素酶基因的转录翻译，催化底物氧化产生化学发光。通过检测并归一化相对化学发光强度，即可定量分析转录因子对靶基因启动子的转录激活 / 抑制能力。对结合位点进行定点突变后重复实验，可进一步验证调控的位点特异性。 体外研究方法：①DNA Pull-down：体外直接结合验证原理：DNA Pull-down 是基于生物素 - 链霉亲和素亲和层析的体外 DNA - 蛋白互作验证技术。将含转录因子结合位点的靶基因调控序列进行生物素标记，作为特异性探针并固定于链霉亲和素磁珠上；随后与核蛋白 / 重组蛋白样品共孵育，特异性结合 DNA 的转录因子会被磁珠捕获。经多次洗涤去除非特异性结合蛋白后，洗脱富集的蛋白产物，利用蛋白质免疫印迹检测目标转录因子，从而验证二者的体外直接结合关系。②酵母单杂交（Y1H）：体外筛选 + 定点验证原理：基于转录因子与顺式作用元件的特异性结合激活报告基因表达。将目标顺式 DNA 序列构建至报告基因上游作为诱饵，整合入酵母基因组；将待测转录因子基因构建为猎物载体并转化该酵母菌株。若转录因子可特异性结合诱饵 DNA，会激活下游报告基因表达，使酵母在选择性筛选培养基上正常生长或产生显色反应，以此判定 DNA - 蛋白的特异性结合。既可验证已知的DNA-蛋白结合，也可结合cDNA文库筛选未知结合蛋白。通过以上体内外验证可以明确转录因子的下游靶基因。但是当我们研究全新转录因子、需要解析全基因组范围的调控网络，仅靠单个候选基因验证远远不够。此时需要结合多组学技术来明确下游靶分子及调控网络。 第三步：多组学联合技术RNA-seq 转录组测序：筛选转录因子干预后，全基因组范围内表达发生变化的基因，区分表达上调 / 下调靶基因。ChIP-seq 染色质免疫共沉淀测序：全基因组水平，定位转录因子在细胞内真实结合的 DNA 区域，是体内 DNA - 蛋白结合的高通量金标准，对应潜在直接靶基因。CUT&Tag：ChIP-seq 的升级替代技术，同样用于全基因组定位转录因子结合位点。无需甲醛交联和超声破碎，利用抗体靶向结合后，通过蛋白A-Tn5转座酶复合物在结合位点原位切割并加接头，直接获取DNA片段。ATAC-seq 转座酶可及性染色质测序：检测基因组染色质开放区域，通俗来说染色质分为开放区域和致密闭合区域，闭合区域染色质结构致密，转录因子结合可及性显著降低；而开放区域DNA 松散暴露，是转录因子、RNA 聚合酶发挥作用的场所。Tn5转座酶在开放染色质区域插入效率显著高于闭合区域，对细胞基因组进行酶切、建库测序，从而定位全基因组的染色质开放区域。 多组学经典组合逻辑组合 1：RNA-seq + ChIP-seq / CUT&TagRNA-seq → 筛选表达差异基因（包含直接和间接调控靶点）；ChIP-seq/CUT&Tag → 得到TF 直接结合基因集；两组数据取交集：交集基因 = 转录因子高可信度直接下游靶基因（既被TF直接结合、位于开放染色质区域，且表达受TF调控，是机制研究首选）组合 2：RNA-seq + ChIP-seq/CUT&Tag + ATAC-seq染色质开放区域 + TF 结合区域 + 表达差异基因。三重交集靶点，证据链最完整，可完整阐释通路：染色质开放 → 转录因子结合 → 基因表达改变组学技术与前文分子实验的串联关系 组学（RNA-seq/ChIP-seq/CUT&Tag/ATAC-seq）：全局初筛，批量锁定候选靶基因；分子实验（ChIP-qPCR、双荧光素酶、DNA Pull-down、酵母单杂交）：单点验证，对组学筛选出的核心基因逐一做实结合与调控功能。完整递进路线：生信预测 → 多组学全局筛选 → 分子实验验证（结合+调控）→ 靶基因功能 rescue → 细胞/动物表型闭环。 |
回复此楼» 猜你喜欢
综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？
已经有12人回复
-
2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B?
已经有4人回复
-
应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键
已经有29人回复
-
奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样
已经有9人回复
-
是这周出结果还是下周出结果？
已经有3人回复
-
小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊
已经有9人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有4人回复
-
帮忙看看fileCode
已经有13人回复
-
为什么网上很多人说本周 12号出结果
已经有7人回复
-
读博的好处
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
