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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞实验小白必看！手把手完整教学质粒转染，步骤清晰不踩雷
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一、实验前准备 1. 材料与试剂细胞株：HEK-293T（对数生长期，状态良好）转染试剂：线性聚乙烯亚胺（PEI，分子量25 kDa，无菌无内毒素）质粒DNA：目的质粒（需经去内毒素试剂盒提取，OD260/280 ≥ 1.8，浓度≥0.5 μg/μL）培养基：完全培养基：DMEM（高糖）+ 10% 胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素/链霉素（双抗）转染专用培养基：Opti-MEM（无血清、无抗生素）其他：PBS（无菌，pH 7.4）、细胞裂解液（如RIPA，含蛋白酶抑制剂）、5× SDS-PAGE上样缓冲液（含/不含DTT）2. 质粒质量控制（关键步骤）使用前必须检测质粒纯度：OD260/280 应在1.8 ~ 2.0之间，OD260/230 > 2.0。注意：提取过程中出现的白色絮状沉淀多为残留蛋白，过吸附柱时务必避免吸入，否则会严重抑制转染效率并增加细胞毒性。 二、实验步骤 （1）细胞铺板（转染前一日）培养皿准备：以6 cm培养皿中的293T细胞为例，细胞融合度达80%~90%时可用于传代铺板。传代比例：一个6 cm皿的细胞量可均匀铺至 3个12孔板（即每板4孔，共12孔，每个6 cm皿对应3个12孔板的所有孔，实际操作中按需调整）。铺板操作：弃去旧培养基，用PBS洗涤一次，胰酶消化后收集细胞，用完全培养基重悬并计数。调整细胞密度，以 每孔1 mL完全培养基 接种于12孔板中，确保转染当日（铺板后约16~18小时）细胞融合度达到 70%~80%。铺板时间推荐：前一天晚上20:00铺板，次日中午12:00左右进行转染，此时密度最为适宜。设置对照孔（提前规划）：空白对照组（Mock）：不加质粒和PEI，仅加等量Opti-MEM，用于检测细胞基础状态及培养基背景。阴性对照组（Negative）：加等量PEI但不加质粒，或转染空载体（如不含目的基因的对照质粒），用于排除转染试剂和操作本身对细胞的影响。阳性/实验组：转染目的质粒。、 （2）转染前换液（转染当天）转染前，从培养箱中取出12孔板，逐孔吸弃旧培养基。每孔加入 500 μL Opti-MEM（无血清、无抗生素），轻轻摇动使覆盖均匀，放回培养箱中静置 30~60分钟（此步为“饥饿处理”，可提高细胞对复合物的摄取效率）。注意：换液操作要轻柔，避免冲起贴壁不牢的细胞。转染全程使用无血清体系，以防血清中的成分干扰PEI-DNA复合物形成。 （3）制备PEI-DNA转染复合物（每孔用量，以12孔板计）计算DNA用量：每孔推荐转染 1.5 ~ 2.0 μg 质粒DNA（具体需根据质粒大小、报告基因表达强度预实验优化）。稀释DNA：取无菌EP管，加入 50 μL Opti-MEM。加入计算好的质粒DNA（例如，若质粒浓度1 μg/μL，则加1.5 μL），轻轻吹打混匀，标记为 管A。稀释PEI：PEI与DNA的质量比（PEI  NA）通常为 3:1（如1.5 μg DNA对应4.5 μL PEI，2 μg DNA对应6 μL PEI）。此为常用比例，可据细胞系和质粒调整（范围2:1 ~ 4:1）。取另一EP管，加入 56 μL PBS（无菌无钙镁），再加入计算体积的PEI（例如4.5 μL），吹打混匀，标记为 管B。室温静置 10分钟。混合形成复合物：将管A（DNA-Opti溶液）全部加入管B（PEI-PBS溶液）中，或用移液器将二者轻柔混合。室温孵育 10~20分钟，使DNA与PEI充分自组装形成带正电荷的纳米复合物（此时间窗口精确控制，过长或过短均影响转染效率）。加入细胞：孵育结束后，将每孔对应的复合物混合液（总体积约50+56+质粒体积 ≈ 106~110 μL）逐滴均匀滴加至对应孔中。加入后，手持培养板前后左右轻柔摇晃数次，使复合物分布均匀，随即放回37°C、5% CO₂培养箱。（4）转染后换液与培养转染后4小时（关键时间点）：取出培养板，吸弃含有PEI-DNA复合物的旧液（该液体对细胞有一定毒性，不宜长时间保留）。每孔加入 1 mL 新鲜完全培养基（含血清、双抗），放回培养箱继续培养。若为病毒包装或重组蛋白表达，通常继续培养 48~72小时 后收样；若为瞬时表达报告基因，可在24~48小时检测。 （5）样品收集根据实验目的，分别收集上清（分泌蛋白/病毒颗粒）和细胞（胞内蛋白/RNA）样品。1. 上清样品收集（用于检测分泌型蛋白或病毒滴度）将培养板上清液吸至1.5 mL离心管中。4°C，12,000 × g 离心10分钟，小心吸取上清至新离心管（去除细胞碎片及死细胞）。重复离心一次，将最终上清转移至新管，分装后于 -80°C保存备用（或立即用于检测）。2. 细胞样品收集（用于Western blot、qPCR等）PBS洗涤：吸弃培养基，每孔加入1 mL预冷PBS，用移液器轻轻吹打或刮刀将细胞刮下，收集至离心管中。低速离心：800 × g 离心10分钟（注意：勿用12,000 × g，该转速会破碎细胞，导致核蛋白释放，影响胞质/核蛋白分析）。弃上清，加入1 mL PBS重悬细胞沉淀，再次 800 × g 离心10分钟，弃上清（共洗涤2次）。裂解：根据沉淀量，加入 80 μL 细胞裂解液（如RIPA，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂），用枪头吹打分散，冰上裂解 30分钟，期间每10分钟涡旋振荡一次。澄清裂解液：4°C，12,000 × g 离心10分钟，小心吸取上清（即总蛋白提取物）至新管。为彻底去除不溶物，可重复离心一次，收集最终上清，-80°C保存。 （6）制样（用于SDS-PAGE电泳）取 40 μL 上清（或细胞裂解上清）至PCR管或EP管中。分别加入 10 μL 5× SDS上样缓冲液：还原性样品（检测二硫键依赖的蛋白）：加含DTT的缓冲液（DTT+）。非还原性样品（检测多聚体/天然构象）：加不含DTT的缓冲液（DTT−）。若样品量有限，可按 20 μL 样品 + 5 μL 缓冲液 的比例配制。煮沸变性：将PCR管置于 100°C 加热块或PCR仪中，煮沸5~10分钟，使蛋白完全变性。冷却后短暂离心，样品可直接上样电泳，或置于 -20°C 保存（可保存约1个月），避免反复冻融。建议：使用八联排PCR管配合PCR仪煮样，操作便捷且温度均一。 |
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