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CRISPR 高通量流式筛选踩坑总结：从建库到分选关键要点
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CRISPR文库筛选突破了传统单基因研究的局限，能够以无偏向性的方式系统筛选调控细胞表型的关键基因，已成为挖掘功能基因和发现潜在药物靶点的重要技术手段。针对细胞表面分子表达、报告基因活性等可通过荧光信号表征的表型，流式分选技术可实现不同表型细胞群体的精准分离。结合CRISPR筛选与流式分选，通过对不同表型群体进行sgRNA测序分析，解析sgRNA富集与耗竭规律，可高效定位影响细胞功能的关键调控因子，广泛应用于免疫调控机制研究及肿瘤治疗靶点挖掘等领域。 一、基于流式分选的CRISPR筛选应用场景 在CRISPR文库筛选体系中，流式分选并非“万能工具”，但在特定应用场景中几乎不可替代：只要能够将生物学问题转化为可被荧光信号强度表征的表型变化，就可以借助流式分选实现高效的功能基因筛选与靶点挖掘。 常见能筛的靶点类型主要有这几大类： 1.信号通路活性 / 转录因子活性调控靶点 可利用报告基因系统（如由特定响应元件驱动的GFP表达）或免疫染色方法，将信号通路活性转化为可量化的荧光强度变化。例如，在筛选NF-κB、Wnt、p53、HIF-1α等通路的新型调控因子时，可通过流式分选获取GFP高表达或低表达的细胞群体，或结合免疫染色对信号强弱进行分群分选，从而进一步解析并鉴定该通路的正向或负向调控基因。 Huang M,et al.Mol Cell. 2023[1]。该研究建立并验证了基于流式分选的CRISPR筛选实验体系，可应用于鉴定DNA损伤应答等多种信号通路的调控因子。 2.细胞表面标志物调控靶点 利用流式细胞术进行筛选是肿瘤免疫研究中最常用的策略之一。例如，在探索调控PD-L1、MHC-I、CD47等免疫检查点或抗原呈递分子表达的相关基因时，可采用荧光标记抗体进行细胞表面染色，并通过流式分选获取目标蛋白高表达或低表达的细胞群体，随后对不同群体进行NGS测序分析，从而鉴定其潜在调控基因。该类筛选无需构建报告基因系统，可直接在野生型细胞文库中开展，更贴近真实生理状态。 Rahimov F,et al.Nat Commun. 2025[2]。该研究利用基于流式分选的CRISPR筛选实验体系，在人源单核细胞系中系统性鉴定出295个IL-1β调控基因。 3. 细胞分化/ 转分化 / 干性调控靶点 利用谱系特异性表面标志物（如干细胞相关的CD133，以及分化细胞的特定Marker），或结合分化报告体系，对分化标志阳性/阴性细胞群体进行分选，即可进一步鉴定驱动或抑制特定分化进程的关键基因。 Teske M,et al.Nat Commun. 2025[3]。研究利用流式细胞术，基于CRISPR全基因组筛选鉴定出调控小鼠血内皮细胞命运的核心转录因子。 4.代谢物感应 / 酶活性靶点 部分荧光探针可直接反映细胞内代谢状态变化，例如ROS水平、脂质含量以及溶酶体pH等指标。基于这些荧光信号，可通过流式分选获得信号发生偏移的细胞群体，从而进一步筛选与代谢状态相关的调控基因。此外，还可结合基于荧光底物的检测体系，用于筛选蛋白酶、激酶等酶活性的调控因子。 5.病毒感染 / 细菌入侵相关宿主因子 通过使用荧光标记的病原体或报告病毒体系，可对感染阳性与阴性细胞进行分选，并据此识别影响病原体入侵或复制的宿主限制因子及易感因子。 二、流式分选用于文库筛选的基础操作流程 1.制备单细胞悬液：采用酶解消化或机械吹打方式处理样本，收集细胞悬液后通过细胞筛过滤，确保细胞充分分散为单细胞状态，全程严格遵循无菌操作规范。 2.荧光标记染色：结合筛选实验需求，添加活死细胞鉴别染料、细胞表面特异性抗体；也可直接依靠报告基因自带荧光信号完成标记。 3.仪器上机分选：将标记完成的细胞样本载入流式分选仪，划定目标细胞分群（例如荧光强度最高的前 10% GFP 阳性细胞），通过分选通道将目标细胞收集至预先添加细胞培养基地收集管中。 4.细胞回收培养与基因组提取：分选获得的目标细胞分两份处理，一部分细胞传代培养，用于后续功能验证；其余细胞经离心富集后提取基因组 DNA，开展 sgRNA 高通量深度测序分析。 三、流式分选的关键注意事项与实验设计要点 1.流式分选更容易产生假阳性结果 相比药物筛选，流式分选本质上仅对目标细胞进行一次物理层面的富集过程。在此过程中，部分细胞可能由于细胞周期所处阶段、代谢状态的瞬时波动，或随机出现的报告基因短暂高表达，而被误判并进入设定的阳性门。 这些具有“暂时性表型”的细胞在分选时会被一次性全部收集，而缺乏后续多轮筛选中的自然淘汰与再验证过程。因此，相较于多轮药物筛选体系，流式分选得到的阳性候选列表中，假阳性的比例通常更高。 【小源Tips】可以进行多轮富集，将收取到的细胞进行培养后再度分选，以此获得更纯的阳性细胞。另外，通过增加重复组别，也能在一定程度上排除假阳性结果的干扰。 2.确保分选所需细胞量充足 若流式分选获得的细胞数量过少，将导致文库覆盖度显著下降，使得大量sgRNA无法被有效检测到。同时，在低细胞量条件下，分选过程中由随机误差富集的“假阳性细胞”对整体筛选结果的干扰也会明显增强，从而影响结果的可靠性。 【小源Tips】流式分选通常分选出荧光占比前后5-10%的细胞群，为了保证分选出的细胞有足够的覆盖度，在分选前通常需要准备1*10^7以上细胞量用于分选（对于全基因组文库则需要更多）。 3.提防细胞聚团对实验结果的干扰 文库筛选过程中，细胞通常需经历慢病毒包装、感染及抗性筛选等多步处理，细胞膜表面黏附性往往有所增加。同时，在分选细胞数量较大或细胞浓度较高的情况下，也更容易形成细胞团块。 一旦产生微小细胞聚团，流式分选仪可能将其误判为单一事件，从而引入数据偏差；同时还可能在分选过程中造成细胞损失增加，甚至直接堵塞喷嘴，严重影响实验的正常进行。 【小源Tips】将细胞分成多份进行摇床染色，避免细胞量过多导致部分细胞无法被染色的情况，同时可以加入1-2mM的EDTA和25–50 U/mL DNase I以减少细胞聚团的现象。在分选前还需要用40 μm 筛网过滤，以避免分选过程中堵塞喷嘴。 4.抗体染色不均匀或特异性问题对结果准确性的影响 相比常规流式分析实验，流式分选通常需要处理更大量的细胞，更容易出现抗体染色不均匀的情况，从而导致仅部分细胞完成有效标记。另一方面，若抗体特异性存在问题，也可能导致最终分选得到的细胞群并非目标细胞群，从而对实验结果造成显著干扰。 【小源Tips】在进行流式分选正式实验之前，需要先进行预实验，确保抗体有效性，还可以通过设置不表达目的蛋白的阴性对照组以及加入Fc封闭液以排除抗体的非特异性结果对实验结果造成的干扰。 5.分选过程需尽量减少细胞损伤 流式分选过程通常耗时较长，并且对细胞具有一定程度的损伤。因此，需要尽可能降低分选过程中对细胞造成的应激与损伤，否则可能导致分选后的细胞快速发生凋亡或DNA降解，进而严重影响后续的基因组提取以及NGS测序分析的质量与可靠性。 【小源Tips】通过使用超高速流式分选系统（如贝克曼MoFloAstrios EQ ）以减少分选时长，同时在流式细胞收集管中加入适量的分选缓冲液，以降低分选过程中的物理冲击对细胞造成的损伤。 四、源井生物CRISPR文库服务 源井生物面向各类科研应用场景，构建了完善的表型筛选与数据分析平台，提供覆盖实验设计到结果解析的精细化CRISPR体内/体外筛选服务，助力科研项目高效推进。其多样化表型分析平台可支持多种功能筛选体系需求，全面覆盖药物或病毒处理、传代培养、细胞共培养、流式分选、细胞迁移及贴壁等多类筛选操作。 此外，源井生物iScreenAnlys™文库分析平台支持文库筛选数据“一键分析”，可集成Drug-Z、MAGeCK-RRA、MLE等主流生物信息学算法，直接生成可用于发表的图表与分析结果。    |
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