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不做蛋白定量，凭感觉上样=搞玄学 已有1人参与
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为什么定量不能省 同一个实验，三组不同的处理，各组细胞量完全一样，裂解液体积也一样，但细胞状态、处理效果、裂解效率不同，每管裂解物中的真实蛋白浓度可能会相差很大。 如果不做定量，直接按体积等量上样，相当于拿三个起点不同的样本去做对比。 WB的定量分析，无论是内参归一化还是总蛋白归一化，都建立在"上样总蛋白量一致"这个前提上。跳过定量直接上样，后期数据分析时就算有差异，也无法确认是实验造成的差异，说不定本来没差异，你上样量不同才造成差异的。 而且，实验数据不是只做出一次就OK了，还需要实验重复，有的同学重复数据做来做去都不好，也需要考虑一下是不是没做定量的原因。 蛋白定量用什么方法 目前最常用的两种蛋白定量方法是BCA法和Bradford法，各有各的适用场景。 BCA法 BCA（二喹啉甲酸）法的原理是：在碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，BCA 试剂与Cu⁺结合形成紫色复合物，在562nm处有强吸收。颜色深浅与蛋白浓度成正比。 这种方法目前在实验室使用的是比较多的。但如果你提蛋白时，用的裂解液或试剂盒或提取方法需要加入DTT 、β-巯基乙醇来辅助提取的话，就可能不适合用BCA，因为这些还原剂会被当成蛋白，将Cu²⁺还原为Cu⁺，最后显色时让读数偏高。 Bradford法 Bradford法的原理是：考马斯亮蓝G-250在酸性条件下与蛋白质结合，染料的最大吸收峰从465nm移至595nm，通过测定595nm的吸光度来计算蛋白浓度。 如果目标蛋白（如脂蛋白、某些坚韧性蛋白）富含甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸而几乎不含碱性/芳香残基，则蛋白与考马斯亮蓝G-250染料的结合效率远低于BSA，导致严重低估实际量。 BCA和Bradford两种方法本身没有绝对的好坏，关键是适配自己的样品体系。选择一种方法后，尽量在整批实验中使用同一种方法，避免交叉带来额外误差。 4 上样量怎么定 蛋白定量完成后，等量上样的计算结果很简单：用测得的蛋白浓度算出每孔需要吸取的体积。 例如：测得某样本蛋白浓度为2μg/μL，计划每孔上样10μg，则每孔需要5μL蛋白液。如果每孔上样体积为10μL，就可以按照5μL的蛋白液+3μL的RIPA+2μL的5× Loading Buffer混合（使 Loading Buffer 总浓度为 1×），煮沸变性后上样。 关于上样量的参考值，这里有一份简单的范围建议： 常规细胞裂解物，每孔20μg总蛋白通常足够 蛋白丰度较低的目标，可适当提高到40-60μg 组织样本通常需要更多，40-80μg是常见范围 如果目标蛋白丰度很高，可以先从10μg开始尝试 初次做某个蛋白的WB时，建议做一个上样量梯度测试。从10μg到60μg设置几个梯度的上样量，观察目标蛋白的信号强度和线性关系，找到最适合的上样量。 其他注意事项 稀释标准品或样品 如果样品是RIPA裂解的，标准品和样品也应该用同样的RIPA来稀释——不同的缓冲液体系会影响显色反应。 上样体积一致 不同泳道的上样体积相差过大会影响电泳效果。如果各样本浓度差异较大，可用裂解液将各组样品稀释至相近浓度，使上样体积尽量一致（通常控制在10-20μL/孔）。 点样孔不要留空 上样布局中，如果有空余的泳道，需要用1×Loading Buffer补齐至与样本孔相同的体积，防止边缘效应导致的条带变形。 上样量一致了，但内参条带还是不齐 在排除定量、个人操作方面、样本来源一致等问题后，这个现象说明蛋白可能降解了。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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