| 查看: 27 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
蛋白-蛋白互作验证，实验思路梳理
|
|
做分子、细胞、机制研究的小伙伴，大概率逃不开一个核心课题：两个蛋白到底有没有相互作用？不管是基因机制挖掘、通路上下游验证，还是靶点互作筛选，蛋白-蛋白互作（PPI）都是最基础、最核心的机制论证逻辑。很多同学实验做多、数据一堆，却始终逻辑混乱：到底先做哪个实验？为什么要联合验证？怎样的数据才能被审稿人认可？今天这一篇推文，就来梳理一下蛋白互作验证的完整实验体系+层级思路。 01 蛋白互作的“四大核心问题”1.有没有结合？这是最基础的一步：你的两个目标蛋白，在细胞里到底能不能碰到一起、发生结合？2.在哪里结合？结合不是 “乱碰”，是有特定 “靶点” 的。找到两个蛋白互作的关键结构域或氨基酸位点，才能让你的研究从 “相关性” 走向 “机制性”。3.结合后发生了什么？两个蛋白结合，会改变彼此的命运：是稳定了对方、还是促进了降解？是改变了亚细胞定位、还是影响了翻译后修饰？这些都是互作带来的直接影响。4.最终影响了什么表型？所有分子层面的互作，最终都要落脚到细胞、动物乃至疾病的表型上。敲掉互作位点，通路还能不能激活？疾病的进展会不会被改变？这才是互作研究的意义。 02 蛋白互作研究实验基本思路第 1 步：寻找潜在的互作分子在没有明确候选蛋白时，我们需要先通过无偏向性的方法，找到和目标蛋白互作的分子。方法有：IP + 质谱（IP-MS）（最常用）、酵母双杂交（Y2H）、邻近生物素标记（BioID/APEX）这样子可以拿到一份潜在互作蛋白明细，为后续验证提供候选方向。需要注意的是这一步只是 “初筛”，质谱结果里有很多假阳性，必须经过后续实验严格验证，不能直接作为结论。 第 2 步：锁定靶点 —— 找到结合的关键位点 当我们证明了蛋白蛋白可以结合，下一步就要搞清楚 “它们到底是怎么结合的”。首先使用计算机模拟（分子对接）先通过蛋白结构数据库，用分子对接软件预测两个蛋白可能的结合界面，给出候选的关键氨基酸位点或结构域，为后续突变体构建提供方向。实验验证（突变体构建）根据预测的位点，构建关键结构域或氨基酸的突变体，再用 Co-IP 或 GST-pull down 验证：当这些位点突变后，两个蛋白还能不能结合？如果结合消失了，就证明我们找到了真正的互作位点；如果结合还在，说明预测的位点不对，需要重新分析或换思路。进行到这里我们究竟是把 “模糊的结合” 变成 “清晰的机制” 了，这是论文能上高分的重要加分项。 第 3 步：功能闭环 —— 从分子互作到疾病表型前面我们证实了两个蛋白可以互作，之后我们就需要回答这个互作，到底有什么用？1.蛋白本身的功能影响：两个蛋白结合后，会不会影响彼此的表达量、稳定性或翻译后修饰？比如结合后，其中一个蛋白被泛素化降解，或者被磷酸化激活？2.互作会影响下游通路的激活：比如两个蛋白结合后，某个通路的关键分子磷酸化水平发生变化？3.细胞层面的表型验证：敲低 / 过表达其中一个蛋白，或者突变互作位点后，细胞的增殖、凋亡、迁移等表型会不会改变？4.疾病层面的验证：在动物模型或临床样本中，验证这个互作是否真实存在，并且和疾病的发生发展相关。比如在肿瘤组织中，两个蛋白的结合水平是否比癌旁组织更高？等等...... |
回复此楼» 猜你喜欢
国自然申请五篇代表作大比拼，感觉这个是最重要的
已经有10人回复
-
无聊看看时间戳打发时间
已经有4人回复
-
中！中！中！
已经有9人回复
-
限项问题
已经有3人回复
-
职称论文投稿
已经有9人回复
-
基于自然哲学类比的风化壳型稀土矿
已经有14人回复
-
评委有多少概率知道其他专家手中有哪些人的本子？
已经有6人回复
-
求推荐期刊，重谢
已经有3人回复
-
青A35岁以下通知答辩了吗
已经有4人回复
-
小城的小雨
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
