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科研战神来了新虫 (小有名气)
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GST-pulldown 杂带多、无结合？根源与解决方法汇总
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GST-pull-down 实验标准化操作流程（纯化蛋白-体外互作体系）实验原理简述：本实验利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签与谷胱甘肽（Glutathione）磁珠/琼脂糖珠的高亲和力，将“诱饵蛋白”（GST融合蛋白）固定于固相载体上。当细胞裂解液或纯化的“猎物蛋白”（His标签蛋白）流过时，若两者存在相互作用，则猎物蛋白被捕获，最后通过SDS-PAGE及Western Blot检测互作情况。设立GST空载体对照组是为了排除猎物蛋白与GST标签本身或琼脂糖珠的非特异性结合。 一、 实验前准备：蛋白纯化与定量靶标蛋白纯化：分别纯化带有His标签的目的蛋白（猎物蛋白）与带有GST标签的目的蛋白（诱饵蛋白）。关键对照设置：同步纯化GST空标签蛋白（即仅表达GST标签的空载体转化蛋白），作为后续实验的阴性对照组，用以排除非特异性背景。蛋白浓度测定与调整：纯化完成后，使用BCA法或Bradford法精确测量上述三种蛋白溶液的浓度。注意事项：蛋白浓度是决定后续加样体积的核心依据。若测得浓度过低，需使用超滤浓缩管（如Millipore Amicon Ultra）于4℃低温离心浓缩，确保实验体系的加样量在可控范围内。 二、 实验操作流程（主要步骤） 第一天：GST珠子平衡与蛋白孵育（过夜） 谷胱甘肽琼脂糖珠（GST Beads）的预处理：轻轻颠倒混匀GST Beads悬液，分别取100 µL的Beads悬液加入两个干净的2 mL低吸附离心管中（标记为“实验组”和“GST空载对照组”）。于4℃，2000 rpm离心2-3分钟，小心吸弃上清保存液。加入1 mL预冷的Binding Buffer重悬洗涤Beads，平衡2次后，吸弃上清，保留管底凝胶状珠子备用。 实验组与对照组混合体系配制（以1 mL总反应体系为准）：实验组：将纯化好的GST-诱饵蛋白与His-猎物蛋白混合于含有预处理Beads的管中。空载对照组：将GST空标签蛋白（浓度与诱饵蛋白相同）与等量His-猎物蛋白混合于另一含有预处理Beads的管中。加样量的确定（关键参数）：参考既往文献标准，推荐基础上样量为 5 µg GST融合蛋白 + 2 µg His蛋白。但鉴于本次蛋白浓度较低，为确保结合效率，按比例扩大5倍上样量，即实际加入 25 µg GST融合蛋白（或GST空蛋白）与 10 µg His猎物蛋白。实验者可依据自身蛋白的丰度及浓度进行等比例微调。 最后用预冷的Binding Buffer将两管反应体系分别补足至1 mL，轻轻颠倒混匀。将离心管固定于旋转混合仪上，于4℃冰箱中过夜旋转孵育（建议旋转时间不少于6-8小时，以保证充分结合）。 第二天：洗涤去除非特异性结合与蛋白洗脱 低温离心收集珠子：将过夜孵育后的样品取出，于4℃条件下，2000 rpm离心5分钟，小心吸弃上清液（含有未结合的游离蛋白）。严格洗涤（清除背景噪音的关键）：向管中加入1 mL预冷的Wash Buffer（配方：Binding Buffer + 现添加的 1× Protease Inhibitor Cocktail，即蛋白酶抑制剂混合物）。盖上管盖，上下反复轻柔颠倒混匀（切勿剧烈涡旋，以免破坏珠子结构），洗涤10分钟。洗涤完毕后，于4℃、2000 rpm离心5分钟，吸弃上清。重复上述洗涤步骤共6～8次，以最大限度地去除弱结合及非特异性结合的杂蛋白。蛋白变性洗脱（上样前处理）：完成最后一次洗涤并彻底吸干上清后，向管底珠子沉淀中加入 30 µL的 1× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（Protein Loading Buffer，含DTT或β-巯基乙醇）。使用金属浴或水浴锅，98℃高温变性煮样10分钟，使结合的蛋白复合物从珠子上解离并变性。 离心取上清：煮样结束后，于室温（或4℃）下12000 rpm高速离心10分钟，以沉淀琼脂糖珠残渣。小心吸取离心后的上清液，转移至新的EP管中，此即为最终的Pull-down产物样品，准备好进行后续的SDS-PAGE电泳及免疫印迹检测。  |
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