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2023-2026年NGS建库方法调研：酶切会取代超声吗？
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如果把时间拨回十年前，在NGS实验室里，DNA片段化几乎等同于超声打断。无论是全基因组测序（WGS）、外显子组测序（WES），还是ChIP-seq等表观遗传学研究，研究人员通常都会先将DNA送入超声仪，通过物理方式将其打断至数百bp长度，再进行后续文库构建。 然而近几年，一个明显的变化正在发生。越来越多商业化建库试剂盒开始采用酶切法（Enzymatic Fragmentation）替代传统超声打断，一些自动化建库平台甚至直接将酶切作为默认方案。对于很多实验人员来说，这似乎预示着DNA片段化技术正在迎来一次新的迭代。那么，随着酶切技术不断发展，超声片段化会不会逐渐退出历史舞台？ 为了寻找答案，我们查阅了近年来公开发表的NGS建库方法学研究以及高影响力测序论文，对当前DNA片段化技术的发展趋势进行了梳理。结果发现，行业的发展方向并非简单的“新技术取代旧技术”，而更像是两条技术路线在不同应用场景中的持续优化。 酶切技术崛起，DNA片段化正在发生变化 对于Illumina、华大等二代测序平台而言，DNA片段化始终是文库构建过程中不可或缺的一步。无论研究对象是人类基因组、肿瘤组织还是环境微生物样本，DNA通常都需要先被打断至特定长度范围后才能进入后续建库流程。 在二代测序快速发展的早期阶段，超声一直是最主流的DNA片段化方式。其原理是利用超声波空化效应使DNA发生随机断裂，从而获得适用于测序建库的片段长度。由于整个过程不依赖酶反应，因此能够避免因酶识别位点导致的序列偏好问题。 但随着NGS逐渐从科研领域走向临床检测和高通量应用，实验室对于建库效率和自动化水平的要求不断提高。相比之下，酶切法操作更加简单，对自动化平台更加友好，同时能够减少部分样本损失，因此受到越来越多试剂厂商的青睐。 近年来，越来越多建库试剂盒开始采用酶切策略，DNA片段化领域也逐渐从过去以超声为主导，发展为超声与酶切并行发展的格局。也正是在这样的背景下，“酶切是否会取代超声”成为越来越多人关注的话题。 被忽视的步骤，为什么会影响测序结果？ 在很多实验人员看来，DNA片段化只是建库流程中的一个步骤。然而大量研究表明，这一步骤对最终测序结果的影响远比想象中更大。 理想的DNA片段化不仅需要获得目标长度，还需要保证片段分布均匀、随机性好，还要减少额外偏倚的引入。如果片段长度分布过宽，可能导致文库复杂度下降；如果断裂过程存在明显序列偏好性，则可能影响覆盖度均一性；而如果建库过程中产生额外背景噪音，则可能进一步影响变异检测结果。 尤其是在肿瘤NGS、低频突变分析以及全基因组测序等应用中，研究人员越来越关注文库质量对最终数据准确性的影响。 换句话说，DNA片段化决定的不仅是DNA被切成多长，更关系到后续测序数据是否可靠。[1] 调研发现：超声与酶切已经形成“双主流格局” 2022年发表于《BMC Genomics》的一项研究指出[2]，目前基因组DNA片段化最常见的两种方式就是Sonication（超声片段化）和 Enzymatic Fragmentation（酶切片段化）。 酶切法之所以快速增长，主要原因在于其具备较好的自动化兼容性和操作便利性。对于大规模样本处理和临床检测实验室而言，简化流程往往意味着更高的检测通量和更低的人力成本。因此，越来越多商业建库方案开始采用酶切技术。 但与此同时，我们在查阅近年来公开发表的测序研究时发现，超声片段化并没有因为酶切技术的发展而被边缘化。相反，在全基因组测序、肿瘤基因组学以及表观遗传学研究中，超声依然保持着极高的使用频率。 例如在2025年发表于《Nature Communications》的一项研究中[3]，研究团队利用FFPE肿瘤样本开展全基因组测序分析。在文库构建过程中，研究人员采用超声方式将DNA剪切至约300-400 bp，并最终获得了满足临床分析要求的高质量测序数据。这表明即使面对存在一定降解的FFPE样本，超声片段化依然能够支持可靠的文库构建和后续基因组分析。 为什么许多高质量研究仍然选择超声？ 答案首先来自随机性。 2022年的研究指出，超声能够产生接近随机（near-random）的DNA断裂模式，从而减少片段化过程中的序列偏好。由于超声属于纯物理打断方式，其过程不依赖任何酶识别位点，因此理论上能够在整个基因组范围内获得更加均匀的断裂分布。 对于全基因组测序、外显子组测序、甲基化测序以及ChIP-seq等应用而言，这种随机性往往意味着更均匀的覆盖度和更好的数据一致性。 除了随机性之外，变异检测准确性也是研究人员关注的重要因素。2024年《BMC Genomics》[4]的一项研究，里面对同一样本分别采用超声建库和酶切建库进行比较分析，结果发现酶切文库检测到的SNV和Indel数量明显高于超声文库。研究人员进一步分析认为，其中部分差异可能来源于建库过程中产生的伪影（artifact）。 这些结果表明，DNA片段化策略不仅会影响文库构建过程，也可能对后续变异检测结果产生影响。因此，在许多强调数据准确性和实验重复性的研究项目中，超声依然是研究人员广泛采用的片段化方法。 超声与酶切对比表 指标 超声片段化 酶切片段化 随机性 高 中 序列偏倚 低 相对较高 自动化兼容 中 高 长度控制 优秀 良好 WGS应用 广泛 广泛 ChIP-seq应用 广泛 较少 临床高通量检测 增长中 增长最快 酶切越来越火，超声还会存在多久？ 那么，随着酶切技术不断普及，超声片段化是否会逐渐退出历史舞台？ 从目前的发展趋势来看，这种可能性并不大。 酶切法近年来增长迅速，其优势主要体现在操作简便、自动化兼容性高以及对低起始量样本更加友好。对于临床检测实验室和大规模高通量建库平台而言，这些特点能够有效提升实验效率，因此酶切技术的应用范围仍在不断扩大。 但另一方面，超声片段化所具备的较低序列偏好性、接近随机的断裂模式以及良好的实验重复性，依然是许多高质量测序研究所关注的重要特性。特别是在全基因组测序、肿瘤基因组学、表观遗传学等对数据质量要求较高的领域，这些优势仍然具有重要价值。 因此，与其讨论酶切是否会取代超声，不如思考不同应用场景究竟需要怎样的片段化策略。对于强调效率和自动化的应用而言，酶切法无疑具有明显优势；而对于强调数据质量和结果可靠性的研究项目，超声依然是重要选择。 参考文献 [1] Head SR, Komori HK, LaMere SA, et al. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. DOI: 10.2144/000114133. [2] Ribarska, T., Bjørnstad, P.M., Sundaram, A.Y.M. et al. Optimization of enzymatic fragmentation is crucial to maximize genome coverage: a comparison of library preparation methods for Illumina sequencing. BMC Genomics 23, 92 (2022). DOI:10.1186/s12864-022-08316-y. [3] Domenico D, Gundem G, Levine MF, Arango-Ossa JE, Robbe P, Asimomitis G, et al. Enabling whole genome sequencing analysis from FFPE specimens in clinical oncology. Nat Commun. 2025;16:10649. DOI:10.1038/s41467-025-65654-7. [4] Chen, H., Zhang, Y., Wang, B. et al. Characterization and mitigation of artifacts derived from NGS library preparation due to structure-specific sequences in the human genome. BMC Genomics 25, 227 (2024). DOI:10.1186/s12864-024-10157-w. |
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