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科研战神来了新虫 (小有名气)
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反复重染还是高背景？蛋白质银染避坑指南，新手也能一次成功
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第一部分：准备工作（决定成败的90%）别小看这一步，背景花了、出黑点，99%是前期没做到位。电泳液：必须新鲜配制！别偷懒用昨天的，微生物繁殖或离子浓度变了，跑出来的胶后续染色容易出纹理。电泳槽：拆开仔细刷洗，尤其是电极丝和胶板缝隙。用自来水冲掉残胶后，ddH₂O 反复淋洗 3 遍。器皿洁癖：我强烈推荐直接用新开封的 10 cm 一次性塑料培养皿做染色盒。玻璃器皿容易残留银离子或洗涤剂，是背景加深的元凶。水：全程电阻率 18.2 MΩ·cm 的超纯水，普通蒸馏水不行的哈！摇床：室温（20-25℃），转速固定在 60-70 rpm。太猛了胶容易碎，太慢了反应不均匀。 第二部分：试剂配制建议用 50 mL 离心管 来分装配制，方便操作。以下配方是按 100 mL 总体积 算的，实际根据胶的大小按比例增减。1. 固定液（经典配方）无水乙醇：50 mL冰乙酸：10 mLddH₂O：40 mL 顺序无所谓，混匀就行。2. 30% 乙醇洗涤液无水乙醇：30 mLddH₂O：70 mL3. 银染增敏液（重点！降低背景的神器）无水乙醇：30 mL冰乙酸：5 mL戊二醛（25%）：100 μL（终浓度 0.025%）硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃·5H₂O）：20 mgddH₂O 补足至：100 mL⚠️ 临用前现配！戊二醛和硫代硫酸钠加进去后混匀，避光放置。4. 银溶液（核心显色剂）硝酸银（AgNO₃）：0.2 gddH₂O 补足至：100 mL☠️ 避光操作！硝酸银见光分解，用锡纸把瓶子包起来。现配现用，配好就染。5. 显色液（条带出现的关键）无水乙醇：30 mL甲醛（37%）：300 μL（一定要临加！）无水碳酸钠（Na₂CO₃）：2.5 gddH₂O 补足至：100 mL注意顺序：先用水把碳酸钠摇溶了，再加乙醇和甲醛。6. 终止液冰乙酸：5 mLddH₂O：95 mL如果想长期保存干胶，可以再加 5 mL 甘油，防止胶变脆。 第三部分：详细操作流程（按部就班，稳赢）电泳结束，撬开玻璃板，把胶滑进培养皿里（注意正反面），开始以下操作：① 固定（时间越久背景越干净）溶液：固定液时间：室温摇动 至少 1 小时。专家私藏：我一般直接扔摇床上固定过夜（12-16小时）。别怕，胶不会坏，背景能洗得跟白纸一样干净！② 30% 乙醇洗涤（过渡清洗）溶液：30% 乙醇时间：摇动 10 分钟。作用：把固定液里的乙酸和残留SDS置换出来。③ 超纯水洗涤（继续降背景）溶液：ddH₂O时间：摇动 ≥ 10 分钟（15分钟更佳）。注意：这一步水洗充分了，后面的银染背景才会通透。④ 增敏（2分钟，短平快）溶液：银染增敏液时间：精准计时 2 分钟！关键：倒掉水后迅速倒入增敏液，到点立马倒掉。多一秒都可能让背景发灰。⑤ 增敏后水洗（两次，快速）溶液：ddH₂O第一次：摇动 1 分钟，弃液。第二次：摇动 1 分钟，弃液。目的是冲掉多余的戊二醛，但别冲太久，不然增敏效果就没了。⑥ 银染（10分钟，避光）溶液：银溶液时间：精准计时 10 分钟。操作：倒入后立马把培养皿用锡纸盖住，放在摇床上轻轻晃。到点立刻倒掉银液（记得回收废液）。⑦ 银染后水洗（生死时速1.5分钟！）溶液：ddH₂O时间：严格控制在 1 分钟到 1.5 分钟之间！ 掐着秒表来！血泪教训：坚决不能超过 1.5 分钟！超过这个时间，结合在蛋白上的银离子就被洗脱下来了，后面怎么显色条带都淡淡的，别怪我没提醒你。⑧ 显色（盯紧了，别眨眼）溶液：显色液时间：3 - 10 分钟（动态观察）。操作：倒入显色液后，就在旁边守着看。一般 1-2 分钟开始出条带。当目的条带清晰可见，背景微微泛黄但还没变深时，立刻终止！千万别去洗个手再回来看，回来就全黑了。 |
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