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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞提 RNA 完整操作指南｜从收样到测浓度一步不缺
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实验目的与原理在细胞生物学研究中，常需提取细胞总RNA，通过逆转录获得cDNA，再利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测目标基因在mRNA水平的表达量。本实验采用Trizol法提取RNA，其原理是利用异硫氰酸胍和酚等成分快速裂解细胞并抑制RNase，再通过氯仿抽提、异丙醇沉淀获得高纯度RNA。实验前准备耗材：无RNase的枪头、离心管（1.5 mL EP管）、一次性手套、口罩、帽子。试剂：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、75%乙醇（用DEPC水配制）、DEPC水。器材：4℃低温离心机、涡旋振荡器、冰盒、移液器、超净台（或干净通风区域）。细胞准备：六孔板中培养的细胞，密度适宜（通常80%~90%融合度）。 一、详细实验步骤1.细胞裂解吸除细胞培养液，用预冷的PBS轻轻洗涤细胞1~2次（去除残留培养基和血清），吸净PBS。每孔（六孔板的一个孔）加入 1 mL Trizol，室温下置于摇床或手动震荡 3~5 min，使细胞充分裂解。室温静置 10 min，促使核蛋白复合物完全解离。💡 若细胞量较少（如12孔板或96孔板），可相应减少Trizol体积（如0.5 mL），后续氯仿等按比例调整。2.氯仿抽提向裂解液中加入 250 μL 氯仿（Trizol:氯仿 = 4:1）。盖紧管盖，剧烈上下颠倒或涡旋震荡 15秒，直至溶液呈粉白色乳浊液（充分混匀）。室温静置 15 min，使水相和有机相清晰分层。 3.离心分层设置离心机为 4℃，12,000 rpm，离心 15 min。离心后，液体分为三层：上层无色水相（含RNA）、中间白色薄层（DNA/蛋白质）、下层粉色有机相（酚、氯仿）。 小心吸取上层水相（约400~500 μL）至新的无RNase EP管中，切勿触及中间层及下层。 ✔️ 判断标准：吸出的液体应对光呈透明淡黄色；若呈粉红色，表明吸入了有机相，需重做。4.RNA沉淀向上清中加入 500 μL 异丙醇（体积约为水相的1倍），轻轻颠倒混匀。室温静置 15 min（推荐）或 -40℃过夜（可提高低丰度RNA产量）。5.沉淀收集4℃，12,000 rpm，离心 15 min。 离心后管底可见白色胶状沉淀（RNA）。小心弃去上清（可用移液器吸除），保留沉淀。 6.洗涤RNA加入 1 mL 75%乙醇（用DEPC水新鲜配制，预冷更佳），轻柔颠倒或轻微弹动管壁，使沉淀漂浮并得到洗涤。 ⚠️ 注意：此步要紧盯白色沉淀，避免吸弃或倒弃沉淀。4℃，10,000 rpm，离心 10 min。7.干燥与溶解小心吸除全部上清（乙醇）。可短暂离心后吸尽残留液体。将EP管开盖置于干净、无尘、通风处（如超净台内）晾干，直至RNA沉淀由白色变为半透明状（约5~10分钟）。 ❌ 切勿过度干燥，否则RNA难以溶解。根据沉淀大小，加入 30~50 μL DEPC水（沉淀多则加50 μL，沉淀少则加30 μL），轻轻吹打混匀，冰上溶解10~15 min，可短暂涡旋助溶。8.浓度测定与保存取1~2 μL RNA溶液，使用微量分光光度计测定浓度及纯度（OD260/280应在1.8~2.0之间，OD260/230>1.8）。RNA样品可立即用于逆转录，或分装后于 -80℃冰箱长期保存（避免反复冻融）。 二、注意事项严防RNase污染所有枪头、离心管、移液器套筒等均需无RNase认证。操作台面、移液器等用RNase清洁剂擦拭。实验全程佩戴口罩、干净手套、一次性帽子，避免口鼻、头发、皮屑污染。环境要求在人少、封闭、无气流扰动的专用区域提取RNA（最好在超净工作台中）。操作时动作轻柔，避免剧烈呼吸或交谈。关键步骤提示吸上清时宁少勿多，若吸到中间层或粉色有机相，可导致DNA/蛋白质污染。75%乙醇洗涤后，务必吸尽乙醇，否则残留会抑制下游逆转录反应。晾干时不要完全干透（RNA变白脆裂则难溶）。样品标识所有EP管务必清晰标注样品名称、日期，避免混淆。 |
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