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科研战神来了新虫 (小有名气)
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qRT-PCR 总不出阳性结果？全套标准化操作流程收好！
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一、RNA提取（以TransZol Up法为例） 1.样品裂解取不超过50 mg的样品，加入1 mL TransZol Up试剂（若样品量极少，如<50 mg，可加入0.5 mL），用匀浆机充分匀浆。匀浆注意事项：动物或植物样品需充分匀浆，匀浆时宜采用“少量多次”原则，避免样品飞溅或泡沫过多。匀浆后，室温静置5分钟，使核蛋白复合体完全解离。 2.相分离每1 mL TransZol Up加入0.2 mL RNA萃取液（如氯仿或等效萃取液），用手或移液枪反复吹吸混匀（不可仅靠振荡）。室温涡旋振荡5分钟，确保充分乳化。以上操作（匀浆至振荡）均应在冰上进行，以抑制RNA酶活性。 3.离心分层于2～8°C下，10,000 rpm离心15分钟。离心后样品分为三层：无色水相（上层，含RNA）、中间层（DNA和蛋白）、粉红色有机相（下层）。小心吸取上层水相至新离心管中，为避免中间层污染，可适当留取部分水相不吸取。 4.RNA沉淀向水相中加入等体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀（不必剧烈振荡），室温静置5分钟。 5.RNA柱结合将上述混合液（含沉淀）全部转移至离心柱（已置于收集管中），室温12,000×g离心30秒，弃流出液。 6.去蛋白（DNase I可选）向离心柱中加入500 μL CB9 Buffer（结合液），室温12,000×g离心30秒，弃流出液。重复本步骤一次（共两次CB9洗涤）。可选步骤：若需去除基因组DNA，可在CB9洗涤后加入DNase I工作液，室温静置15分钟，随后再次用CB9洗涤一次。 7.洗涤RNA向离心柱中加入500 μL WB9 Buffer（洗涤液），室温12,000×g离心30秒，弃流出液。重复本步骤一次（共两次WB9洗涤）。8.去除残留乙醇空柱室温12,000×g离心2分钟，彻底去除乙醇残留（避免影响后续洗脱效率）。 9.RNA洗脱将离心柱转移至新的RNase-free离心管（试剂盒提供）中，向柱膜中央加入50～200 μL RNase-free Water。室温静置1分钟，使RNA充分溶解。室温12,000×g离心1分钟，收集RNA溶液。 10.保存RNA样品建议分装后于-80°C长期保存，避免反复冻融。 二、RNA浓度和纯度测定 1.浓度检测使用NanoDrop或类似分光光度计检测RNA浓度。一般建议：RNA浓度 < 100 ng/μL 时，后续逆转录效果较差，不宜进行后续qPCR实验。推荐起始量：逆转录反应中总RNA投入量为500 ng～1 μg（依试剂盒而定）。 2.纯度评估OD260/OD280 比值应在 1.9～2.1 之间，表明RNA纯度较高（蛋白、酚类污染少）。若比值偏低，提示蛋白或酚污染；若比值偏高（>2.2），可能存在RNA降解。同时记录OD260/OD230 比值（应>1.8），以评估盐类/有机溶剂残留。 三、逆转录 (RT)：mRNA → cDNA 1.体系配置（推荐大体系）总RNA（1 μg）+ 随机引物/Oligo(dT) + RNase-free Water → 65°C 5分钟，冰上骤冷。加入5× RT Buffer、dNTPs、RNase抑制剂、逆转录酶 → 补至40 μL。为满足后续多基因检测需求，建议配置 40 μL 逆转录体系（常规为20 μL）。示例体系（以All-in-One逆转录试剂盒为例）： 2.反应程序25°C 10分钟（引物退火）42°C 60分钟（cDNA合成，依酶种可调至50°C）85°C 5分钟（灭活逆转录酶）4°C保存 3.cDNA保存建议将cDNA稀释2～5倍后分装，-20°C短期保存（<3个月），-80°C长期保存。 四、引物稀释与qPCR体系配置 1. 引物设计与稀释引物设计原则长度：18～25 bpTm值：55～60°C，上下游引物Tm相差不超过2°CGC含量：40%～60%扩增产物长度：80～200 bp（qPCR推荐）引物稀释步骤将干粉引物离心（12,000×g，3分钟），按管身标注加入相应体积的TE Buffer或RNase-free Water，配成100 μM储存液。使用前稀释至10 μM工作液（例如：10 μL 100 μM引物 + 90 μL RNase-free Water）。 2. qPCR反应体系配置（以SYBR Green法为例）推荐体系（20 μL） 注意事项每个样品至少设置3个技术重复。建议加入ROX参比染料（若仪器需要）。体系配置需在冰上或低温操作台上进行，避光（SYBR Green光敏感）。 五、qPCR循环参数与策略选择 方法选择建议三步法（变性-退火-延伸分离）： 扩增效率更高，适合低丰度基因或产物较长（>150 bp）的检测。两步法（退火与延伸合并）： 特异性更高，非特异性扩增风险低，适合高特异性要求的实验，但扩增效率可能略低于三步法。推荐策略：优先尝试两步法（特异性优先），若扩增效率不理想（Ct值偏大或无扩增），改用三步法。所有qPCR实验结束后必须进行熔解曲线分析以确认产物特异性（单峰合格，双峰提示引物二聚体或非特异扩增）。 |
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