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科研战神来了新虫 (小有名气)
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实操教程｜2 分钟掌握标准细胞铺板技巧
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一、实验前准备超净台紫外灭菌： 开启超净工作台紫外灯，照射灭菌 40 分钟。试剂平衡至室温： 从 4℃ 冰箱中取出 PBS、胰酶、完全培养基（以下简称“完培”），置于室温环境下回温 30 分钟，避免冷试剂影响细胞状态。 二、细胞消化与收集超净台准备： 关闭紫外灯，开启风机。用 75% 酒精擦拭台面，点燃酒精灯（若需明火操作）。 所有试剂瓶身、移液管、离心管等均用酒精喷雾消毒后放入超净台。吸弃旧培养基： 取出细胞培养瓶，瓶口过火焰（或使用酒精棉擦拭）灭菌。轻轻吸弃瓶内旧培养基。PBS 清洗：沿瓶壁加入 5 ml PBS，轻轻摇晃培养瓶使 PBS 覆盖所有细胞生长面，可轻柔吹打数次。吸弃 PBS。重复清洗 2～3 次，以充分去除残留血清和代谢废物。 胰酶消化：加入 2～3 ml 胰酶（以覆盖瓶底为宜），轻轻晃动使胰酶均匀分布。设置计时器（常用 1～3 分钟，视细胞类型而定）。将培养瓶置于倒置显微镜下观察：当细胞逐渐变圆、细胞间隙增大、部分细胞开始脱落时，立即终止消化。终止消化与细胞悬液收集：迅速加入 2 ml 完培（含血清）中和胰酶。用移液枪或吸管反复轻柔吹打瓶底细胞层，注意避免产生气泡。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管 中。另取一支装有等量 PBS 的离心管作为平衡配重，800 rpm 离心 5 分钟。 三、细胞重悬与计数离心后处理：离心结束后，从离心机取出离心管，喷洒 75% 酒精后放入超净台。小心吸弃上清液（避免吸走细胞沉淀）。加入 1～4 ml 完培（根据沉淀量调整），用移液枪反复轻柔吹打 20～30 次，制成单细胞悬液。台盼蓝染色计数：细胞悬液 90 μl完培 810 μl（即稀释 10 倍）0.4% 台盼蓝染液 100 μl取一个 1.5 ml 或 2 ml EP 管，依次加入：充分混匀，静置 2～3 分钟。吸取 10 μl 混合液，打入细胞计数板（血球计数板或自动计数板），在显微镜下计数四个大方格内的活细胞（拒染细胞）。 四、铺板浓度计算与稀释目标细胞密度：96 孔板每孔加入 100 μl 悬液，要求含 6000 个细胞。铺板总体积估算：计划铺 120 个孔（含实验孔和对照孔）。每孔 100 μl，理论需悬液 = 120 × 0.1 ml = 12 ml。建议预留损耗（枪头残留、混匀转移等），实际配制 13.5～14.0 ml 细胞悬液。细胞悬液配制（以用户数据为例）：取原细胞悬液 60 μl。加入完培 13.86 ml。总液量 = 13.92 ml（足够 139 孔使用，留有充足余量）。混匀：用移液管或大口径枪头反复吹吸 10～15 次，确保均匀。 五、96 孔板铺板操作设置对照组：无细胞对照组（空白组）：只加完培（不加细胞），用于检测培养基背景及排除污染。可选 药物对照 等根据实验设计另行添加。铺板注意事项：使用多通道移液枪或单道枪加样，每加 1～2 排（8～16 个孔）后，立即再次轻轻混匀细胞悬液（避免细胞沉降造成孔间差异）。加样时枪头尖端悬空于孔底上方，避免接触孔底或产生气泡。建议从边缘向中心加样，或按 S 型顺序加样，减少操作误差。边缘孔处理：在 96 孔板最外圈一周（所有边缘孔）各加入 100 μl 无菌 PBS 或不含细胞的完培。目的：减少培养过程中边缘孔培养基蒸发造成的边缘效应（Edge Effect），保证内部孔温湿度和渗透压稳定。轻摇混匀： 铺板结束后，将 96 孔板水平十字晃动数次，使细胞在孔内均匀分布。 六、培养与后续静置： 将 96 孔板平稳放入 37℃、5% CO₂ 细胞培养箱中，静置 30 分钟 让细胞贴壁（悬浮细胞可略过）。长期培养： 根据实验需要继续培养 24～72 小时，期间避免频繁震动或移动培养板。记录： 在培养板盖或实验记录本上注明：细胞类型、铺板密度、日期、分组信息等。 |
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