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科研战神来了新虫 (小有名气)
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搞定质粒扩增！转化与摇菌关键要点
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实验原理 受体细胞（如大肠杆菌DH5α）经化学试剂（CaCl₂）或热激处理后，细胞膜通透性暂时改变，质粒DNA或重组载体可进入细菌体内，利用细菌的复制系统实现质粒的快速扩增。本实验采用pLKO.1-U6-EF1a-copGFP-T2A-puro载体，携带氨苄青霉素抗性基因及GFP-Puro标记。 一、实验材料与储存条件 1. 已接收样品（公司提供）对照质粒：1管（pLKO.1空载，浓度100 ng/μL）目的质粒：3管（shRNA#1、#2、#3，浓度100 ng/μL）甘油菌：3管（含目的shRNA的DH5α菌液，甘油终浓度约20-30%）穿刺菌：3管（半固体培养基保存，4°C储存备用） 2.储存方法 样品类型：质粒DNA，储存温度：-80°C(长期)或-20°C(短期)， 甘油菌 储存温度：-80°C 穿刺菌 储存温度：4°C 3.实验试剂与耗材感受态大肠杆菌DH5α（-80°C保存）LB液体培养基、LB固体培养基（含氨苄青霉素）氨苄青霉素（储存液100 mg/mL，工作浓度100 μg/mL）无酶水、50%无菌甘油1.5 mL EP管、15 mL/50 mL离心管、涂布棒、移液枪及无菌吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）水浴锅、恒温摇床、37°C培养箱、金属浴、离心机、NanoDrop ONE 二、质粒转化（针对对照质粒及目的质粒） 注意：全程无菌操作，在生物安全柜中进行。紫外灯消毒15-20 min，提前预冷冰盒。1.准备步骤从-80°C取出感受态细胞DH5α，立即置于冰上缓慢解冻（约5-10 min）。取出待转化的质粒DNA，冰浴备用。用无酶水将质粒原液（100 ng/μL）稀释10倍，得到10 ng/μL的工作液。 2.涂板与培养制备选择性LB平板：含氨苄青霉素（100 μg/mL）。室温放置至表面干燥。涂布：取复苏后的菌液50-100 μL（每90 mm平板不超过200 μL），用无菌涂布棒均匀涂布于平板表面。吸收：正置平板，室温静置5-10 min，直至菌液完全被吸收。倒置培养：将平板倒置放入37°C恒温培养箱，培养12-16 h，直至出现清晰单菌落。备份：剩余菌液可暂时4°C保存备用（若平板未长出菌落，可重新涂布）。注意：若使用放置过久或失效的平板导致无克隆生长，可取4°C暂存的菌液，37°C摇30 min恢复活性，重新涂布新平板。 三、单克隆挑选与小量扩增（用于小提质粒） 1.准备摇菌管：取无菌15 mL离心管，加入5 mL LB液体培养基，并加入5 μL氨苄青霉素（100 mg/mL储存液，1:1000稀释），终浓度100 μg/mL。2.挑取单克隆：用10 μL无菌吸头轻轻触碰平板上单个清晰的菌落，连吸头一起打入上述离心管中。3.摇菌：旋松管盖（保证通气），将离心管斜插于摇床内，37°C、200-220 rpm振荡培养12-16 h（过夜）。4.质粒小提：次日取过夜菌液，按照质粒小提试剂盒（如Omega、TIANGEN）说明书操作，提取质粒DNA。剩余菌液可4°C短期保存。 四、甘油菌（直接扩增与保存） 适用于已构建好的甘油菌（如Sh#1、#2、#3），无需转化步骤。 步骤：在15 mL或50 mL离心管中加入LB培养基和相应抗生素。从-80°C取出甘油菌，冰上融化后，吸取对应体积加入离心管。旋松管盖，斜插于摇床，37°C、200 rpm振荡培养12-16 h，至菌液明显浑浊（OD₆₀₀ ≈ 2.0-3.0）。2.甘油菌长期保存（新批制备）在生物安全柜中准备无菌1.5 mL EP管，标记菌株名称、日期、代数。每管加入500 μL 50%无菌甘油（终浓度25%）。再加入500 μL 上述新鲜过夜菌液（或原甘油菌复苏后的菌液）。颠倒混匀6-8次，避免气泡。置于-80°C可长期保存（至少3年）。注意：穿刺菌保存于4°C，使用前需用接种环挑取菌苔划线于LB平板（含氨苄）活化，不可直接摇菌。 五、质粒提取与质量检测 1. 质粒提取（小提或中提）根据实验需求选择试剂盒（小提：≤5 mL菌液；中提：50-100 mL菌液）。按说明书操作，常用步骤包括：碱裂解 → 中和 → 离心去沉淀 → 柱纯化 → 洗脱。洗脱：用无酶水或Elution Buffer洗脱，最终体积30-50 μL。2.NanoDrop ONE检测（双链DNA）空白调零：取1 μL无酶水点样，进行Blank校正。检测：取1 μL质粒样品，记录以下指标：浓度（ng/μL）：正常范围200-800 ng/μL（本次提取浓度偏低，约100-300 ng/μL）。A₂₆₀/A₂₈₀：理想值1.8-1.9（本次符合，表明蛋白/苯酚污染低）。A₂₆₀/A₂₃₀：理想值>2.0（本次>2.0，盐/糖残留少）。标记储存：将浓度标记于EP管壁，质粒于-20°C保存。 注：包病毒通常要求质粒浓度≥500 ng/μL，本次浓度偏低，可尝试中量或大量提取，或使用乙醇沉淀浓缩。若需验证序列正确性，可送测序（Sanger法）。 |
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