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WB阴性对照里有条带！
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1 WB实验的阴性对照组出现条带，可能有哪些原因？ 阴性对照出现信号，说明这套WB体系“看到了不该看的东西”。可能的原因包括： A 上样错误：比如上样的时候突然忘了加到哪个样本，或者加串了孔。或者干脆样本制备时带入了其他组的蛋白污染。 B 设备污染：转膜槽、电泳槽、刮刀等会重复使用的器材没洗干净，残留了蛋白、样本或抗体，造成污染。 C 抗体问题：抗体浓度过高，或者特异性不好，看谁都像目标蛋白，发生了非特异性结合，粘上了别的蛋白。 D 阴性了，但没有完全阴性：所谓的“阴性对照”有时可能并非绝对阴性。比如野生型（WT）细胞可能本身就有低水平表达，或者存在正常表达的同源蛋白，或存在一些能被抗体错误识别的剪切体、修饰形式。 2 不同原因导致出现不该有的条带，条带之间亦有差别，原因可能是？ 首先，我们要看看这个不该出现的条带是单阴性对照有呢，还是所有的泳道都有。然后还要看它是菀菀类目的蛋白呢，还是有一大堆杂带。 A 如果条带的位置和目的条带完全一样，只出现在个别泳道： 很可能是今天移液枪心情不好手抖上错样了。比如你阴性对照是KO细胞，结果在50kDa出了条带，还和阳性组长得一模一样——那大概率是你加错样了。 B 如果阴性对照出现了不同分子量的条带，甚至全膜都是杂带： 那更可能是抗体非特异性结合，乱认亲戚。或者是抗体浓度过高、交叉反应等原因。 C 如果所有用同一批样本制备的膜，阴性组都有一样的多余条带： 这种情况可能是样本制备的问题，比如污染，或者离心柱等提取耗材的问题。 D 如果条带很弱，但位置正确，而且跑了好几张膜一直重复出现： 这种鬼上身的情况可能就是内源性表达，样本里确实有这么一个“幽灵“。譬如KO样本的基因敲除并不完全，或者我们刚才说的野生型（WT）细胞可能本身就有低水平表达等情况。 3 如何初步排查？ 发现阴性对照有无中生有的条带，先冷静分析： A 看位置：条带和目的蛋白一样吗？一样 → 查上样和样本；不一样 → 查抗体。 B 看分布：是单个泳道还是多个？局部 → 操作失误；全膜 → 抗体或封闭问题。 C 看强度：很弱的条带更可能是背景，很强的条带基本就是加错样。 4 如何优化？ 除了常规的重新配置浓度、换抗体等以外，在这里还要介绍一个二抗对照实验：不加一抗，只加二抗和底物进行孵育。如果阴性对照泳道还是有条带，说明是二抗的非特异性结合或封闭不充分所致。 WB阴性组出现条带，务必学会从条带的位置和形态中读取线索，你就能从“慌了”和“急了”变成“我悟了”。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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