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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
WB抗体直接拿去做IP？小心翻车！
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很多小伙伴选抗体只看“靶点对不对”，却忽略了关键的一点——不同实验的样本处理方式不同，对抗体的表位识别、特异性、标记方式要求不同。比如同样针对一个靶点，WB能用的抗体，用来做IP可能直接失败，核心原因就是表位识别的差异。WB、FC、IP、ChIP、IF、IHC六种常见实验，对抗体的要求不一样，今天这篇主要总结帮每种实验的抗体选择逻辑。 1WB（蛋白免疫印迹） 实验原理：将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，随后转移至固相载体（如PVDF膜、硝酸纤维素膜），利用抗原-抗体特异性结合反应，通过标记二抗的信号（如化学发光、显色），检测样本中目的蛋白的表达水平及纯度。抗体选择：检测蛋白表达量，样本经SDS变性后呈线性结构，抗体需识别变性后的蛋白。优先选择识别线性表位的抗体，多为人工合成多肽制备的抗体（适配变性后线性化的蛋白）。 2FC（流式细胞术） 实验原理：基于抗原-抗体特异性结合，将荧光标记抗体与细胞表面或胞内的目的抗原结合，通过流式细胞仪检测单个细胞的荧光信号强度，实现对细胞群体中目的蛋白表达量、阳性细胞比例的定量分析，可区分不同细胞亚群。抗体选择：活细胞检测需识别天然构象，优先选择天然蛋白或重组蛋白制备的抗体；固定细胞检测与IHC/IF类似，可选择识别线性或构象表位的抗体。 3免疫沉淀以及染色质免疫沉淀 实验原理：IP（免疫沉淀）：利用抗体与目的蛋白的特异性结合，将抗体-目的蛋白复合物沉淀下来，实现目的蛋白及其互作蛋白的富集与纯化；ChIP（染色质免疫沉淀）：先将染色质与蛋白交联，破碎后用特异性抗体沉淀目的蛋白-染色质复合物，解交联后回收DNA，检测目的蛋白结合的DNA序列。实验核心：IP用于“钓取”目的蛋白及互作复合物，ChIP用于检测蛋白与DNA的结合，两者均需结合天然状态的蛋白。抗体选择：选择识别天然构象表位的抗体，推荐天然蛋白或重组蛋白制备的抗体，避免使用多肽抗体（表位可能被蛋白空间结构包裹，无法结合）。 4免疫荧光（IF） 实验原理：先将已知抗原或抗体进行荧光基团标记，再以该荧光标记抗体（或抗原）作为检测探针，用于探查细胞或组织内对应的抗原（或抗体）。借助荧光显微镜可清晰观察到荧光信号所在的细胞或组织位置，进而明确抗原或抗体的具体性质与定位，同时可通过定量技术精准测定其含量。 5IHC(免疫组化) 实验原理：利用抗原-抗体的特异性结合，通过酶标记的二抗催化底物（如DAB）产生有色沉淀物，在普通光学显微镜下实现蛋白的定位与半定量分析；该技术需经过样本固定、石蜡包埋切片、抗原修复以打破福尔马林交联遮蔽、封闭非特异性位点、一抗与二抗顺序孵育、酶促显色及苏木精复染等步骤，与免疫荧光相比，IHC的优势在于样本可长期存档、无需荧光设备且适用于临床病理诊断免疫荧光和免疫组化抗体选择：在IF/IHC实验中，化学固定剂（如多聚甲醛）通过共价交联维持细胞形态，但导致蛋白质发生变性凝固，使其三维构象与天然状态产生差异；然而，这种固定诱导的变性不同于Western Blot中SDS-PAGE结合加热处理产生的完全线性化变性——后者破坏所有非共价相互作用，仅保留一级结构决定的线性表位，而前者部分保留空间构象，同时暴露部分线性表位。 6各技术抗体选择策略汇总 不同免疫学检测技术对抗体的选择取决于样本处理过程中抗原表位的暴露状态。Western Blot采用SDS-PAGE结合加热还原处理，使蛋白质完全变性为线性结构，因此仅能识别线性表位，推荐使用人工合成多肽作为免疫原制备的抗体。免疫沉淀与染色质免疫共沉淀技术主要是为了捕获天然构象下的蛋白质复合物，需要抗体同时识别线性表位与构象表位，故应以天然蛋白或重组蛋白作为免疫原。免疫荧光与免疫组化技术通过化学固定剂部分变性蛋白质，既暴露线性序列又部分保留空间构象，因此多肽抗原与重组蛋白抗原制备的抗体均可适用。流式细胞术需区分样本状态：固定细胞经多聚甲醛处理后表位暴露模式与免疫荧光类似，可选用多肽或重组蛋白免疫原抗体；而活细胞检测要求抗体识别细胞膜表面维持天然构象的抗原表位，必须采用天然蛋白或重组蛋白作为免疫原制备的构象特异性抗体。 |
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