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原位杂交
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原位杂交 原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。 我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。 原位杂交（In situ hybridazation） 固定 收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成) 一. 原位杂交第一天 1. 重新水化和固定 1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。 2） 置换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟 3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次 4） 置换成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟 5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。 蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步） 1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。 2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。 3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。 4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。 2. 预杂交 1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。 2）用等体积的HYB＋取代HYB－。 3）60℃水浴，预杂交4小时以上。 3. 杂交 1）吸去预杂交的HYB＋，加上100ul已加入探针的HYB＋溶液（探针浓度约为1ng/ul）.. 2）60℃ 温浴过夜。 注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 二. 原位杂交第二天 1. 1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。 2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。 3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。 4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。 2. 1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。 2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。 3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。 三. 原位杂交第三天 1） 用1ml含10％热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。 2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。 3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。 4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色 5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。 6）4C冰箱保存。 原位杂交中溶液的配制： PBS: NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g DEPC H2O 1L HCl 调PH值至7.4 抽滤，灭菌 4% 多聚甲醛： 多聚甲醛 40g PBS 1L 加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存 PBST： PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。 20XSSC: Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽滤，灭菌 SSCT： SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。 HYB-： 甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2：1：1配制 加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20c保存。 HYB+： HYB- 20ml yeast RNA 10mg heparin 1mg。 -20℃保存。 MAB： maleic acid 11.6g NaCl 8.8g 用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.5 4℃保存 MABT MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%. 10% blocking reagent: blocking reagent 8g MAB 72ml 1：2：7溶液： 灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7 用时现配 Staining buffer： Tris 12.1g pH9.5 Mgcl 6H2O 10.2g, Nacl 5.85g Tween-20 1ml, 用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM |
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