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科研战神来了新虫 (小有名气)
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电镜实验必备：贴壁细胞样本制备详细操作指南
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一、贴壁细胞（细胞爬片）电镜样本制备流程1. 实验前准备标记新的24孔板为 B板，用于样本最终保存。在B板各对应孔内预先加入 250 μL 电镜固定液（如2.5%戊二醛，4℃预冷）。检查所需试剂与耗材：预热PBS（37℃）、移液器、弯头超薄镊子、封口膜、冰袋等。 2. 细胞给药/造模结束处理到达预设时间点后，取出培养细胞的 24孔板（标记为A板）。使用1 mL移液器吸弃A板孔内的 培养上清。每孔加入 500 μL 预热的PBS（37℃），轻轻晃动板子以漂洗细胞。吸弃PBS。 → 重复该漂洗步骤共2次，以充分去除残留培养基。 3. 预固定（室温，避光）每孔加入 250 μL 电镜固定液（室温或预冷均可）。室温下 避光固定 10 分钟。 4. 转移爬片与后固定使用 弯头超薄镊子 轻轻夹取A板内的细胞爬片，边缘操作，避免划伤细胞面。将爬片转移至 B板对应孔（该孔已预先加入250 μL 电镜固定液）。确保爬片 完全浸没 于固定液中。室温下 避光继续固定 20 分钟。 5. 保存用 封口膜 严密封闭B板四周，防止液体挥发或渗漏。将B板 水平放置 于 4℃ 冰箱中保存（可保存数周至数月）。 二、悬浮细胞电镜样本制备流程1. 收集细胞将悬浮细胞（含培养液）转移至 5 mL 离心管 中。以 1000 rpm 离心 5 分钟。弃上清，留下 米粒大小 的细胞沉淀。2. 清洗细胞加入 1 mL 37℃预热的PBS，用移液器 轻轻吹打 使细胞沉淀完全重悬。再次 1000 rpm 离心5分钟，弃PBS。 → 重复清洗1次，共2次。3. 固定细胞加入 1 mL 电镜固定液（4℃预冷），用移液器 轻轻吹散细胞，确保细胞 单颗悬浮 于固定液中，避免成团。室温固定 30 分钟（或4℃固定 1–2 小时）。4. 保存固定完成后，4℃ 直立保存 于离心管中（管口需用封口膜或Parafilm密封）。 三、运输注意事项（贴壁与悬浮样本通用）1. 包装要求防漏处理：24孔板（B板）四周及盖缝用 封口膜 + 胶带 双重密封。离心管口需缠绕封口膜，并装入自封袋内，袋口密封。整体固定：将密封好的B板或离心管放入运输盒内，周围用 海绵、气泡膜 塞紧，避免晃动。2. 控温要求（关键）使用 4℃ 蓝冰 作为冷源。禁止使用 -20℃ 冷冻过的冰袋，除非用 棉花或报纸厚实隔开（至少2层报纸+1cm厚棉花），防止样本局部结冰。绝对禁止：固定液（电镜固定液）在运输过程中 结冰，否则冰晶会破坏细胞超微结构。3. 运输标识外包装醒目注明：“生物样本，4℃运输，禁止冷冻”。 |
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