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酶促法DNA合成详解
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DNA合成技术是生命科学产业的关键共性底层技术 作为多学科交叉领域，合成生物学致力于创建新的生物组件、装置和系统，甚至重新设计自然界已有系统，以实现特定的生产目标。这一领域被誉为继DNA双螺旋发现和基因组测序后的第三次技术革命。据McKinsey统计数据，生物制造的产品可以覆盖70%化学制造产品，预计未来生物制造的方式有望对未来医药、化工、食品、能源、材料、农业等传统行业带来深远影响。预计到2025年，合成生物学与生物制造的经济影响将达到1000亿美元，未来10-20年，合成生物学应用可能为全球带来每年2-4万亿美元的直接经济影响。 鉴于合成生物学所展现出的巨大产业潜力，各国均在战略层面对合成生物学进行布局，促使合成生物学产业投资加速，行业进入迅猛发展阶段。 DNA 合成作为合成生物学的关键基础性技术，其重要性堪比测序技术对基因组学的支撑。合成生物学需开发符合生产目的的生物系统，基于工程设计原则的“设计-构建-测试-学习”循环（DBTL）逐渐成为合成生物学的核心策略。 在生物制造领域，DBTL循环四个阶段循环往复可以成功构建需要的细胞，生产出合适的产品。随着海量组学数据的积累和人工智能技术的不断创新，基因的改造设计能力得到了飞速提升，催生了越来越多的基因片段合成需求。行业急需DNA合成技术及设备的创新，解决最底层的成本和效率问题，以进一步加速产业发展。 DNA合成技术发展现状和趋势 DNA合成技术理应像DNA测序技术一样，肩负底层驱动的使命，然而纵观DNA合成技术的发展历程，技术及装备端已无法满足当前高速发展的生物制造需求。目前DNA合成的主流技术是化学合成法，该技术始于20世纪50-60年代，1955年，Michelson和Todd首次报道采用磷酸二酯法实现了寡聚二核苷酸的合成[3]，并获得1957年诺贝尔奖。随后的 60 至 70 年代，寡核苷酸的化学合成方法不断被完善，主要包括改善亚磷酰胺单体的稳定性和反应活性以提高单体偶联步效率，以及优化保护基团的反应活性和产物的稳定性以提高氧化环节的氧化效率等。到20世纪80年代，Beaucage和Caruthers开发了基于亚磷酰胺的DNA合成法，并逐步发展为柱式合成法，也就是我们所说的第一代DNA合成技术[4]。该方法使用十余种化学试剂，通过去保护、偶联、加帽（可选）及氧化4个步骤逐步合成DNA。 据研究，四步循环的合成错误积累的影响下，目前化学合成法的单步偶联效率为98.5%-99.5%[5]，且随着链延长带来合成错误积累。例如，在单步偶联效率为99%的情况下，合成120nt，最终理论产率为30%（0.99^120）；合成300nt，理论产率仅为4.9%（0.99^300），难以纯化出正确序列。因此，目前化学合成法合成DNA的长度极限在200-300nt左右[6]。 为了提高通量，降低成本，从20世纪90年代开始发展起来的第二代DNA合成技术，基于高通量固相芯片的DNA合成策略，如光化学合成法、电化学合成法、喷墨打印法等，单张芯片可实现上万条长度不等的单链 DNA 合成。该类型设备可在提供高通量合成的同时，降低试剂的消耗，初步实现低成本高通量的寡核苷酸合成。相比一代技术，二代技术通量高、成本低，但存在单序列合成载量低，单条序列分离困难等技术局限，使得二代技术的应用场景受限。且其合成原理仍沿用一代合成底层化学法，因此在合成长度、速度、环保等瓶颈问题上仍未突破。当前市场上尚无商业化仪器，开发商仅提供技术服务。 化学合成法可以很好的匹配引物、探针等短片段合成需求，然而，使用短片段DNA拼接为长片段DNA（>1Kb）的工艺繁琐，成本高、周期长，并且随着片段的增长，后续工艺成本及周期成倍增长。但随着合成生物学的发展，行业对于长片段DNA、大片段DNA甚至染色体级别的DNA合成的需求迅速增加，同时迅猛增长的合成量也要求成本进一步降低。 例如，作为生物经济核心的生物制造产业高速发展要求DBTL高效循环，这对DNA合成技术提出了长度、通量、成本全方位的高要求；随着AI技术在生物医药、生物制造产业的广泛应用，新生成的海量DNA序列无法直接使用传统的PCR+克隆的方式获取，这同样要求DNA合成技术成本更低，周期更短才能匹配序列生成速度，快速推进药物研发进度；DNA存储技术已成为最具潜力的数据存储方式，然而传统DNA合成技术成本高、耗时长等问题被广泛认为是DNA存储的主要瓶颈问题。据测算DNA合成成本需较传统化学合成法降低约5-8个数量级，才具备支撑DNA存储产业发展的条件[8]。 DNA化学合成过程中需要大量使用有毒化学试剂，所产生的废液、废气也需要特殊处理。当前绿色发展是大势所趋、潮流所向，世界各国都在推进绿色制造，我国作为制造业大国，更是多次出台发展规划、纲要、指南[9-11]，强调绿色工业制造是建设生态文明的必由之路，这无疑对DNA合成的环保问题提出了更高的发展需求。为此，近年来科研人员发展了很多方法来提高合成效率、降低副反应发生率，其中DNA的生物合成技术备受关注。DNA生物合成技术是指在不依赖于DNA模板的情况下，通过酶促反应实现DNA分子的从头合成。因酶促DNA合成的高效、高准确率、低底物消耗和环保性，使得其有希望解决当前DNA合成面临的问题，被认为是可能突破当前化学合成局限的第三代DNA合成技术。 DNA生物合成技术原理和优势 DNA的从头合成需要非模板依赖的酶来催化DNA链延伸，因此多种有此功能的酶被试用于开发DNA酶法合成技术。Mackey 和Gilham[12] 使用核苷酸磷酸化酶（PNPase）将引入2' 末端封闭的5'-二磷酸-2'-O-（α-甲氧基乙基）核苷酸偶联到寡腺苷酸引物的3' 末端， 定序合成了寡聚核糖核苷酸链。Gillam 和Smith[13]。1999 年，T4 RNA连接酶首次被用于固相酶法DNA合成[14]。然而，以PNPase 和T4 RNA连接酶为代表的连接酶技术方案存在偶联效率低，单轮循环耗时长等局限性，难以商业应用。 末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase, TdT)介导的酶促合成反应是目前生物合成DNA的研究热点。TdT酶是一种可在ssDNA 3’-OH末端连续添加dNTP的DNA合成酶，属于DNA 聚合酶家族X，最早分离于小牛胸腺，并于上世纪八十年代被证实在免疫系统抗体V(D)J 重组中发挥作用，随机合成抗体可变序列区。Bollum 首先发现末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）[15]，并于1962 年提出TdT 可用于单链寡核苷酸合成[16]。1984年，Schott等人发现TdT酶对四种核苷酸偏好性差异小，在无模板时，TdT酶可在寡核苷酸链上随机增加8000个以上碱基，单步反应时间为秒级，具备快速合成长链DNA的潜力[17-19]。因此，行业内普遍采用以末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase, TdT)为核心的循环合成工艺，即在二价金属离子存在情况下（如Co2+、Mg2+），TdT将核苷酸（天然或修饰dNTPs）掺入引发链（Initiators）3'-羟基末端。 然而，基于TdT 的酶促DNA生物合成技术的产业化应用仍需解决以下问题： 01 精准可控合成 在天然核苷酸为底物的情况下，TdT酶可以随机地在引发链的3’-羟基末端添加多个核苷酸，这使得合成过程具有一定的不确定性。为了实现精确的单个核苷酸合成，通常采用经过可逆终止基团修饰的核苷酸。在合成过程中，当引发链掺入单个修饰核苷酸后，该可逆终止基团可使反应终止，从而确保每个合成步骤的准确性。然而，这种终止基团只是暂时的。在另一个反应体系中，引发链末端的终止基团可以被逆转，从而恢复其正常的反应活性。这一过程允许下一轮循环反应顺利进行，从而实现单个核苷酸的精准可控合成。 02 高效合成 由于TdT的结构相对保守，其催化活性腔较小，使其难以有效识别并催化修饰核苷酸。为了克服这一挑战并提高其催化效率，亟需对TdT进行广泛的工程改造，使其能够更好地适应新型修饰核苷酸的结构和特性。 03 稳定合成 除考虑阻断基团的选择和酶的工程改造，稳定合成仍需关注循环条件的优化，如温度、pH值、离子强度等均会影响酶的活性和反应效率。此外，为了推动酶促DNA合成技术在产业化应用方面的发展，尚需进一步关注设备端的工艺稳定性并进行系统的工程优化。这意味着，除了酶促合成技术本身的改进，还需要对相关的设备和工艺流程进行整体优化，以确保其在连续生产过程中的稳定性和可靠性。 事实上，国内外团队已围绕TdT酶，设计了多种不同的TdT酶促合成DNA技术方案。 2016年Carlo Montemagno团队开发了一种核苷酸3’羟基位硝基苯修饰，通过TdT酶可催化链延伸，并通过紫外光切割硝基苯基团，重新形成羟基，实现控制DNA合成的方案[21]，如图7A。然而该方法控制精度较差，难以精确实现单碱基高准确率延伸。 2018年Keasling 团队开发了一种TdT-dNTP共轭体合成的方法，有效控制单次循环只加一个特定碱基，实现了平均精确度为97.7％的DNA生物合成[22]。虽然当时生物合成准确度略低于化学合成法，但通过对TdT酶的改造和反应工艺的优化，准确率和长度几年来不断有新突破。 2020年George M. Church团队开发了一种使用TdT酶合成DNA用于DNA存储的策略[23]。其中使用TdT酶金属离子的螯合剂来终止合成反应，使用光来降解螯合剂，从而重新启动合成反应，以此来链的延伸。该方法难以控制精确的单碱基延伸，但通过后期读取算法，探究了用于DNA存储的可能。 2022年江会锋团队开发鸟类来源高效TdT酶，并使用TdT 酶介导逐步添加经过3’端阻断的核苷酸，结合后再通过化学反应去除“终止子”基团[24]。 由于TdT 酶对于修饰核苷酸反应效率不及自然底物，因此又对酶进行工程改造来提升酶的活性。最终单步准确率高达99.5%，平均准确率达到98.7%，单步反应时间低至30min。 基于上述技术原理，DNA生物合成相较于传统的化学合成，主要有以下显著优势： 01 合的准（合的长） 酶促反应准确率高，工艺优化后，国际已实现从头合成1005 nt单链DNA。 02 合的快 酶促反应速率快，据测算理论添加天然核苷酸的速度可达毫秒级，催化修饰核苷酸底物可实现1-3min的单碱基延伸时间。 03 成本低 酶催化体系底物浓度低，用量少，只需两步循环反应，3种生物试剂，试剂种类较化学合成降低60%以上，成本可降低1-2个数量级。 04 易整合 易于与后续的拼接组装、纠错等生物工艺整合，实现基因一站式合成。 05 安全环保 酶促反应体系所涉及试剂均为水相，安全环保，为设备的去中心化及保密性奠定基础。 第三代DNA合成技术商业化进展 凭借上述独特优势，第三代DNA合成-DNA生物合成技术及产业化应用在2013年之后得以快速发展。 2013年以来，国外先后有Nuclera, Molecular Assemblies, DNA Script, Ansa等多家公司成立，融资超5亿美元，开展DNA生物合成技术及装备的开发、生产及销售业务。另外，诸如Twist、Evonetix等传统化学合成企业也纷纷布局DNA生物合成领域。 尤其是近年来，DNA生物合成技术及装备开发屡有突破，第三代DNA合成技术-生物合成的时代已缓缓拉开序幕。 2021年6月，DNA Script推出世界首台采用酶促技术的台式DNA打印机SYNYAX平台，并于2022年实现初步商业化推广。 2022年7月，中合基因完成国内首台DNA生物合成仪原理样机开发，实现合成长度50nt，单步合成准确率99%，并完成数千万天使轮融资。 2023年3月，Ansa基于Keasling团队在2018年发布的酶促DNA合成技术，宣布成功从头合成1005个碱基的DNA序列。 2023年3月，Molecular Assemblies也公布了新进展，宣称已将第一批酶法合成的寡核苷酸运送给顶尖的生物技术、学术和合成生物学研究人员。 小结 以生物制造及生物医药产业为代表的生命科学产业的飞速发展倒推DNA合成技术向第三代-生物合成技术迈进。DNA生物合成国际竞争格局激烈。DNA酶促合成已经走出实验室进入商业化阶段，在这个方向的玩家将会持续在酶的活性改造、工艺优化、高通量设备和与整合型一体化设备几个方向竞争以求长度、通量和成本的突破，但无疑的是酶促DNA合成的潜力巨大，将为合成生物学注入新的活力。中合基因做为国内生物合成赛道的先发选手，将会全力以赴推进酶促合成设备研发，为合成生物学发展助力。 参考文献： [1] 《2022年中国合成生物学产业发展报告》 [2] 杨永富,耿碧男,宋皓月,等.合成生物学时代基于非模式细菌的工业底盘细胞研究现状与展望[J].生物工程学报, 2021, 37(3):37.DOI:10.13345/j.cjb.200626. [3] Michelson, A. M. & Todd, A. R. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage. J. Chem. Soc. 1, 2632–2638 (1955]. [4] Beaucage S L, Caruthers M H. Deoxynucleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett, 1981, 22(20]: 1859-1862 [5] Deshpande S , Yang Y , Chilkoti A ,et al.Enzymatic synthesis and modification of high molecular weight DNA using terminal deoxynucleotidyl transferase[J].Methods in Enzymology, 2019.DOI:10.1016/bs.mie.2019.07.044.Ma SY, Saaem I, Tian JD. Error correction in gene synthesis technology. Trends Biotechnol, 2012, 30(3]: 147-154. [6] Hoose, A., Vellacott, R., Storch, M. et al. DNA synthesis technologies to close the gene writing gap. Nat Rev Chem 7, 144–161 (2023). [7] 彭凯等.DNA合成,组装与纠错技术研究进展[J].合成生物学, 2020, 1(6):12. [8] 韩明哲等，DNA 信息存储：生命系统与信息系统的桥梁，合成生物学, 2021 [9] 《中国制造 2025》 [10] 《质量强国建设纲要》 [11] 《碳达峰碳中和标准体系建设指南》 [12] MACKEY J K, GILHAM P T. New approach to the synthesis of polyribonucleotides of defined sequence [J]. Nature, 1971, 233(5321): 551-553. [13] GILLAM S, WATERMAN K, DOEL M, et al. Enzymatic syn‐ thesis of deoxyribo-oligonucleotides of defined sequence. De‐ oxyribo-oligonucleotide synthesis[J]. Nucleic Acids Research, 1974, 1(12): 1649-1664 [14] SCHMITZ Carole, REETZ Manfred T.Solid-phase enzymatic synthesis of oligonucleotides[J]. Organic Letters, 1999, 1(11): 1729-1731. [15] BOLLUM F J. Thermal conversion of nonpriming deoxyribonucleic acid to primer [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1959, 234(10): 2733-2734. [16] BOLLUM F J. Oligodeoxyribonucleotide-primed reactions catalyzed by calf thymus polymerase [J]. Journal of Biological Chemistry, 1962, 237: 1945-1949. [17] JENSEN M A, DAVIS R W. 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