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实验解析｜Western Blot跑磷酸化蛋白的难点分析 已有1人参与
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1 实验概述 蛋白质磷酸化属于蛋白质翻译后修饰，在探究某条通路例如MAPK或者NF-κB通路的激活情况，利用蛋白质免疫印记技术检测相关蛋白质（p-p38、p-p65、p-IκB）磷酸化的相对水平，可以分析细胞对于外界刺激的做出变化。而Western Blot检测磷酸化蛋白通常会出现条带模糊、或多杂带等难点，存在许多需要注意的方面。因此，下面主要对跑磷酸化蛋白的难点进行分析和一些经验分享： 2 磷酸化蛋白WB的难点 1. 细胞样本的预处理问题1：磷酸化状态容易发生改变，通常地，当我们用裂解液裂解细胞之后，分离出包含磷酸化蛋白的总蛋白，但此时由于细胞内环境的改变磷酸酶容易被激活，进一步导致磷酸化蛋白发生去磷酸化。解决办法：在细胞裂解时，除了添加蛋白酶抑制剂，裂解液还要按照比例添加磷酸酶抑制剂。 问题2：细胞受刺激后激活相关通路，促使蛋白发生磷酸化；此时磷酸化蛋白的含量相对而言是比较低的，如何获取足够的蛋白上样量。解决办法：首先是保证蛋白的有效提取，将细胞和裂解液混合物收集至离心管后立即置于冰上裂解15min，然后用超声细胞破碎仪充分裂解细胞。离心收集上清后，为了保证磷酸化的完整性和活性，一般现提现用，比普通蛋白的保存要求更高，因此上样的蛋白尽量要新鲜。 2. 选择性价比高的抗体问题1：如何快速定位和选择合适的抗体？ 解决办法：通过查阅文献确定目的蛋白磷酸化位点或者直接通过已知文献确定抗体的购买来源、选择知名品牌或经过验证的磷酸化特异性抗体，比较磷酸化蛋白的效价如何。另外，选择性价比高的抗体，例如售后服务较好、可以试用、显影条带清晰、价格合适，通常磷酸化抗体比普通抗体而言可能会贵一点，可以选择抗体有活动时购买。另外，针对磷酸化蛋白的抗体需要具有高度的特异性，能够准确识别目标蛋白上特定的磷酸化位点；若存在特异性不好的情况，就可能与非磷酸化蛋白发生交叉反应，导致结果出现假阳性或假阴性。 3. 优化膜的封闭和显影问题：封闭背景高，显影时出现大片黑色或黑色小点；条带不明显、没有条带或者条带弥散；条带数量多不能准确定位蛋白位置。解决办法：对于磷酸化抗体来说5%BSA封闭液的封闭效果可能比5%的脱脂奶粉效果更好一些。通常实验室购买的的脱脂奶粉中可能会含有磷酸酶，孵育时就可能对磷酸化的蛋白产生降解。由于磷酸化蛋白本身含量较低，因此要保证上样量足够、上样蛋白新鲜，显色时才能出现条带，另外若是曝光时间足够长（超过1min却一点条带都没有）,就可能说明上述两个问题。另外抗体本身效果不好、特异性差、封闭不好就会出现条带数量多无法确定正确条带的位置。 4. 分析条带问题：磷酸化蛋白到底是一个条带还是两个条带，磷酸化是否是需要跑总蛋白，定量时如何分析。解决办法：条带的数量取决于磷酸化位点的数量和状态，因此在购买抗体时我们就要确定好磷酸化位点，若蛋白具有多个磷酸化位点，这些磷酸化蛋白在电泳时迁移率就可能不同，若是一个蛋白存在两种不同的磷酸化形式且分离效果不一致此时就可能出现两个条带，相反就只有一个条带。另外一种简单的方法就是直接通过查阅文献确定磷酸化位点和抗体购买来源，根据抗体说明书确定条带数目。 通常地，磷酸化蛋白的检测需要设置两个内参，一个是普通内参例如常用的GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）或者β-actin（β-肌动蛋白）而另一个就是磷酸化蛋白对应的总蛋白。普通内参是作为实验组的对照，保证上样量一致的同时排除实验本身的影响。例如分析PI3K/AKT通路，检测AKT磷酸化蛋白的同时也需要检测其总蛋白水平；因为仅仅检测到其磷酸化蛋白表达量发生变化不能充分说明问题，此时需要比较磷酸化蛋白与总蛋白的比值，比值变化表达了磷酸化水平发生相对变化。 3 注意事项 （1）由于磷酸化蛋白的量相对较少，因此接种细胞时，要保证足够的细胞数量6孔板一般1×106~4×106个/孔。（2）超声破碎时，要控制超声的功率、时间间隔；超声间歇可置于冰上降温，避免长时间超声造成蛋白质结构破坏和磷酸化位点丢失。例如设置程序共计破碎次数：80~100次，破碎3s，停3s。1管细胞破碎20次左右，破碎过程发热置于冰上冷却5s。（3）磷酸酶抑制剂可加入如NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸钠或者直接购买商用的蛋白酶、磷酸酶抑制剂，以最大程度抑制磷酸酶活性，防止磷酸化蛋白去磷酸化。（4）使用新鲜的转膜液有助于提高转膜效率和蛋白与膜的结合力。（5）曝光时间要根据信号强度进行调整，可从短时间（如0.5~10s）开始尝试，逐渐增加曝光时间，以获得清晰且背景低的条带图像。（6）磷酸化蛋白的条带数参考抗体说明书。 |
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