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氧化钽纳米颗粒作为X射线计算机断层成像的通用造影剂
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介绍 在这里，我们描述了一系列用于计算机断层成像(ct)的氧化钽(taox)基纳米粒子(nps)的合成、表征和体内外性能。通过溶胶-凝胶法制备了五种不同形式的直径为9-12 nm的硅烷涂覆的taox纳米晶体(ncs ),其具有不同程度的亲水性，并且具有或不具有荧光，具有迄今报道的最高ta含量(78%)。将高亲水性ncs裸露，并在小鼠体内对全身脉管系统的显微ct进行评估，其中静脉注射后，taox ncs表现出高ct对比度，在血液中循环约3小时，并最终在静息器官中累积；并且在乳腺中局部注射后，可以清楚地描绘出完整的导管树结构。部分亲水的纳米颗粒被包裹在介孔二氧化硅纳米颗粒(msnpstaox@msnps)和疏水性ncs被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga；taox@plga)纳米颗粒，用作潜在的ct可成像的药物递送载体。快速肌肉注射taox@plga nps和taox@msnps以模拟肿瘤部位nps的积累，在小鼠中产生高信号增强。对裸纳米细胞和配制纳米颗粒的体外研究表明，taox具有高细胞相容性和低溶出度。这项工作证实了基于taox的纳米颗粒是ct的通用造影剂。 在造影剂(cas)、成像系统、图像采集方案和图像分析策略的创新推动下，x射线计算机断层扫描(ct)已经发展成为一种重要的分子成像工具。ct cas通过衰减x射线位置，在ct图像中产生信号，从而实现分子成像。碘(z=53)是临床上最常用的元素。并且是许多fda批准的ct cas中的可成像成分。含有钡(z=56)的ct cas也用于临床。这些化学元素具有独特的变化的x射线衰减，作为x射线能量的函数，可用于多种分子成像方法，包括双能ct材料分解和光谱光子计数ct. ct分子成像需要制备包含这些元素的新ca，事实上，许多报告已经详细实验了包含银、ag (z=47)、钆、gd (z=64)、镱、yb (z=70)、钽、ta (z=73)、铂、pt (z=78)、金、au (z=79)和铋、bi (z=83)等的ct ca。 ta对当今临床ct系统中使用的x射线具有高衰减(80-140 kvp ),并产生比au或i更高的ct对比度。ta纳米晶体(ncs)、ta2o5和taox的合成方案得到了很好的描述且可重复，分析方法简单明了。此外，多份报告已经证实，ta基纳米材料在生物医学环境中表现出低毒性。最后，ta是一种相对便宜的材料，是商业化的重要长期考虑因素。 通常，表面保护的ta nps被配制成非常小的np，用作可注射的cas。例如，通过异丁酸稳定的ta2o5核上的硅烷表面配体混合物的水解和缩合，制备了两性离子型亚10 nm ta2o5纳米粒子。这些粒子已被证明是一种安全有效的ct ca，在临床ct场景中，特别是在大型成人中，其效率比i更高。在一项单独的研究中，5-10 nm ta2o5纳米粒子也已用于通过与带电软骨基质的相互作用对软骨进行成像。 taox纳米颗粒表面具有与硅烷反应的高倾向性，这用于后续的表面改性，以生成亲水性良好分散的纳米颗粒。 在这项工作中，我们首先合成了一个初步的硅烷涂层taox nc (nc0)，然后我们可以对其进行化学修饰，以赋予不同程度的亲水性和荧光性。这些ncs (nc1)的高度亲水版本被裸露出来，并进行血管/脉管成像研究。这些ncs的适度亲水版本(nc2)和这些ncs的疏水版本(nc3)被分别封装到两个不同的聚合结构中；nc2转化为介孔二氧化硅纳米粒子(msnp ), nc3转化为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米粒子。这两种np类型是有前途的药物递送载体，其中taox使得通过ct进行图像引导药物递送成为可能。使用这一组不同的纳米粒子进行的一组多种多样的体内微型ct演示证实了基于taox的纳米粒子的多功能性和实用性，并且最初的体外和体内毒理学试验表明这些材料具有急性无毒性质，这鼓励了基于taox的纳米粒子在临床ct分子成像方面的进一步发展。 实验 合成程序 taox nc合成:在装有隔膜的250 ml单颈圆底烧瓶中，igepal-co-520[聚(氧乙烯)壬基苯基醚]，mn 44123.0克]，环己烷(200毫升)和乙醇(2.5毫升)，并搅拌内容物以获得澄清溶液。向该搅拌混合物中加入氢氧化钠溶液(100 mm，2.5 ml)，并在水浴中超声处理该微乳液以确保均匀性。接下来，一次加入乙醇钽(v)(ta2o 5，0.5 ml)，并将内容物在环境温度下搅拌20分钟。加入ta2o5后，原本清澈的溶液变得轻微浑浊，表明形成了未包覆的ncs，我们称之为nc0。在反应的这个阶段，加入不同的硅烷端基反应物以形成具有不同程度的亲水性/疏水性的nc，或者将荧光标记附加到nc表面。在单独加入2-[甲氧基(聚乙烯氧基)-9-12-丙基]三甲氧基硅烷(peg-硅烷，3.0 ml)并随后处理后，分离出部分亲水的taox nc2。在同一阶段，添加(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(aptms，0.028 ml)并随后使用甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚胺戊二酸酯(m-peg-sg-200，50 mg)在乙醇产生高度水溶性的taox nc1。改变peg-硅烷和aptms的比例有利于后者的更高浓度(1∶6的比例，v/v)，随后的处理导致疏水性taox nc3。为了合成各自的荧光类似物，在加入peg-硅烷和aptms后，将预先形成的fitc-aptms接头引入反应混合物中，随后的步骤在黑暗中进行。向各自的亲水/疏水反应混合物中加入荧光接头，分别导致形成亲水的fitc-taox nc4和疏水的fitc-taox nc5。一旦反应完成，通过离心将所有类型的nc分离为油状沉淀，并通过使用12-14 kda mwco透析袋在水中彻底透析来纯化，随后冻干以产生干粉形式的nc。 细胞培养 一般信息raw 264.7(鼠巨噬细胞)和hek 293(人胚胎肾细胞)使用补充有10% (v/v)胎牛血清(fbs，gibco)和青霉素/链霉素(100单位ml-1)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基[dmem (1x)，gibco]以单层生长1和100g·ml-1，抗-抗(100-x)，抗生素-抗真菌，gibco ]在37°c、含5% co2的潮湿空气中体外细胞生存力研究使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物测定法对与taox ncs、taox@plga nps和taox@msnps一起孵育的raw 264.7和hek 293细胞的细胞生存力进行评估。在一个典型的实验中，每孔1×104个细胞在96孔板中培养过夜。接下来，将细胞与不同浓度的taox ncs和nps (0、0.0375、0.075、0.15、0.30、0.60、1.2和2.4mg ta ml-1)一起孵育24小时。在孵育期后，用pbs洗涤细胞三次，并与含有mtt试剂(0.5 mg ml-1)的培养基一起孵育4小时，以允许形成甲晶体。接下来，将增溶试剂加入每个孔中，并在进一步温育以完全溶解在先前步骤中获得的紫色晶体后，使用uv-vis微板读数器(spectramax 190，molecular devices)在570 nm处测量来自板的分光光度吸光度。 显微ct成像 体模成像:对于体外体模测量，制备不同浓度(0、20、50、80和100 mm ta)的taox nc1盐水溶液。幻影ct图像是在perkin elmer quantum gx微型ct扫描仪上获得的，该扫描仪在90 kvp和88 a下工作体内微ct我们使用微ct在一系列不同的体内实验中展示了taox纳米粒子的多功能性。 实验1:血管成像。balb/c小鼠(查尔斯河实验室有限公司；性别，男；年龄，~ 3个月；体重约25克)接受100mm(296mg·kg-1 taox颗粒)(n = 2)或200mm(592.3mg·kg-1 taox颗粒)(n = 3)的taox ncs(在无菌盐水(0.9%氯化钠)中配制)的单次静脉剂量。使用perkin elmer量子gx显微ct在0小时(基线)、注射后立即、注射后1小时、3小时、24小时和72小时通过显微ct对动物进行连续成像。 实验2:乳腺导管树成像。fvb mice(查理斯河实验室有限公司；性别，女性；年龄，9-10周)，使用perkinelmer quantum gx微型ct扫描仪在导管内注射后的不同时间连续成像37，使用含有60或100 mm氧化钽纳米晶体的溶液作为造影剂。连续显微ct扫描:2分钟采集；90 kvp/88a；fov，36毫米；体素分辨率，72立方米。 实验#3:成像taox嵌入的纳米颗粒在单个位点的“积累”。taox包埋的nps在单个位点的累积，例如在肿瘤靶向的情况下，通过在右腿和左腿肌肉中以单次大剂量肌肉注射浓缩的nps来模拟。在注射27.4毫克/千克的盐水(50毫米ta)或13.7毫克/千克的盐水(25毫米ta) taox@plga nps和36.8毫克/千克的盐水(50毫米ta)或18.4毫克/千克的盐水(25毫米ta) taox@msnp-phos后，对动物(n = 3)进行显微ct。在单个扫描时间点，使用与实验#1中相同的micro-ct扫描参数评估注射的小鼠；使用caliper analyzedirect，v12.0(生物医学成像资源，mayo clinic，rochester，mn)进行注射后立即进行全身或单个乳腺的显微ct图像绘制、分割和分析。 结果与讨论 taox ncs的合成各种taox ncs的一般合成方法如方案1所示(支持信息，方案s1-s3，esi)。在第一步中，形成表面活性剂促进的微乳液，该微乳液充当用于产生初步taox ncs (nc0)的反应室。在向该微乳液中加入乙醇钽(v)时，碱催化的溶胶-凝胶反应发生，导致nc0.19的快速形成 反应微乳液中的这些初级taox ncs的酸性(ph = 5)表面具有侧羟基，这些侧羟基具有与硅烷进行缩合反应的高倾向，因此，添加具有硅烷封端(peg-硅烷)的聚(乙二醇)部分导致形成良好分散的亲水性taox ncs。 a使用icp-oes报告的ta含量；b直径、pdi和ζ电势使用dls报告；c直径使用image j软件分析的tem图像报告。 taox nc的特性表1列出了不同taox nc类型的详细特性。亲水性nc1的透射电子显微镜(tem )(图1a，b；图s3，esi)和部分亲水的nc2(图1c，d；图s8，esi)分散在水中，和疏水性nc3(图1e，f；图s13，esi)分散在己烷中，证实taox ncs均匀且分散良好，粒径分布较窄，约为9-12 nm。通过动态光散射(dls)测量，分散在水中的nc1和nc2的流体动力学尺寸(粒径)为约12-18 nm(表1)。 x射线衍射(xrd)实验显示了ncs的无定形性质(nc1，图s4；nc2，图s9和nc3，图s14，esi)。使用能量色散谱(eds)和x射线光电子谱(xps)证实了ta及其电子态的存在以及si的存在。所有taox nc变体的eds光谱显示了ta和si的清晰峰，证实了这些元素的存在(nc1，图s5，esinc2，图s10，esinc3，图s15，esi)。 为了评估ncs在这种条件下抗溶解的稳定性，在37℃的磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph 7.4)和柠檬酸钠(nacit，ph 5.5)中进行了为期4周的体外溶解研究。在pbs中孵育模拟细胞溶质和细胞外ph；而nacit，ph 5.5模拟胞吞后溶酶体环境。esi第3.2节描述了本研究的实验细节。简而言之，在37℃下，将taox nc3和taox nc5悬浮在各1 ml的pbs和nacit中，并在整个研究期间(无限下沉条件)的定期时间点取出等分试样，使用icp-oes分析ta含量并归一化以获得累积的ta释放。ta释放绘制在图2中(图s30，esi ),显示了在pbs(图2a)和nacit(图2b)中nc变体的低ta溶出度(< 4%)。各种重金属np在中性条件下的缓慢溶解得到了充分的证明，46╟50然而，在溶酶体ph下不到3%的总ta溶解是令人惊讶的。这清楚地证明了taox ncs在胞质和溶酶体条件下的惰性。 使用icp-oes (n = 3，s.d. < 0.5)在4周内从taox nc3和fitc-taox nc5中溶解ta于a.) pbs (ph 7.4)和b .)柠檬酸钠(nacit，ph 5.5)中。 taox ncs的体外生存力为了评价各种taox ncs的细胞相容性，使用raw 264.7巨噬细胞和hek 293细胞在不同nc浓度下孵育24小时后进行mtt细胞生存力测定。选择nc1、nc2和nc4是因为它们是亲水的，并且在细胞培养基中形成稳定的悬浮液。在两种细胞系中对所有三种nc类型测量了高达2.4 mg ml-1 ta的高细胞相容性(图3a，b；esi +),可能得益于taox ncs的惰性和有限溶解。高细胞生存力与oh等人报道的ritc-taox纳米粒子相匹配。 mtt细胞毒性测定将不同浓度的各种taox nc类型与培养的a.) raw 264.7巨噬细胞和b.) hek 293成纤维细胞各孵育24小时。 静脉注射taox nc1后taox nc1的体内ct成像测量高亲水性taox nc1的体内生物分布，并在分别以100 mm或200 mm ta浓度静脉注射296 mg kg-1或592 mg kg-1 taox nc1后，在小鼠中进行72小时的连续显微ct成像。静脉注射后，nc1在脉管系统中可见，并在循环中保持至少3小时，然后在24-72小时内最终在肝脏和脾脏中蓄积(图5)。脉管系统中的hu值在注射后立即达到最大，并随时间而降低而肝脏和脾脏的浓度逐渐增加，分别在24小时和72小时达到峰值(图6)。这些小鼠是健康的，在整个研究过程中没有表现出任何副作用，如体重减轻、食欲不振或异常行为。 taox nc1在不同ta浓度的盐水中的微型ct体模成像和b .)ct值作为taox nc1在盐水中的ta浓度的函数的线性拟合(线性回归方程:y = 5.69 x╟89.58，r2 = 0.9962)。 体内x射线显微ct成像。a .)在连续扫描时间点(基线0小时、注射后立即、注射后1、3、24、72小时)单次快速给药(217 l，592.3mg·kg-1，iv) 200 mm taox nc1的同一代表性balb/c小鼠的正交视图(冠状、矢状、横向)。hounsfield单位(hu)比例尺显示腔静脉(vc)、脾脏(s)、心脏(h)、肝脏(l)和门静脉(pv)的高信号。 不同器官的ct增强扫描。在200 mm taox nc1的单次单次剂量(217 l，592.3mg·kg-1，iv)之前(基线)和之后，不同时间点不同器官的ct值(hu)。 接受单次大剂量盐水(对照)、100 mm taox nc1 (220 l，296.2 mg kg-1盐水)和200 mm taox nc1 (217 l，592.3 mg kg- 1盐水)的小鼠的心脏、肾脏、肝脏、脾脏和膀胱的组织学变化，然后在注射后72小时进行解剖。切片在h&e中染色，在光学显微镜下放大20倍观察。箭头指向肝脏和脾脏区域的肾梗塞和坏死区域。比例尺为50μm。 乳腺导管树的活体x线显微ct成像。a)在导管内施用40升60毫米taox单次导管内施用后的系列扫描时间点[基线、注射后立即(p.i .)、注射后2、24、96、144小时]的相同代表性fvb小鼠的腹部视图(上图)和3d重建hounsfield单位(hu)直方图范围标准化为0 hu到800 hu。每个注射导管树的3d重建的颜色显示了渲染对象的平均体素强度(hu)。 注射taox ncs后乳腺导管树的成像。在这里，我们证明了taox nc1局部给药的能力，并非常详细地揭示了鼠导管树的连续非吻合分支结构。值得注意的是，使用taox nc1的小鼠的导管树可视化明显优于使用isovue-300的小鼠，isovue-300是一种含碘的ca，在临床上用于诊断导管造影。37虽然iso vue-300在注射后立即迅速扩散出注射的导管树，但37 taox nc1在导管树内保留超过5天，从而能够对整个导管树网络进行重复成像(图8)。 乳腺癌导管内注射70%乙醇预防肿瘤形成的功效。37在乙醇中加入60 mm taox nc1使我们能够在治疗过程中观察整个导管树的充盈情况。在未来的研究中，taox nc1可用于高危个体局部消融预防性治疗的临床评估。 结论 极其亲水的taox nc1在静脉注射后在脉管系统中产生高体内ct对比度，具有延长的血液循环时间，对于100 mm ta剂量没有测量到显著的毒性。taox nc1乳腺垫的导管内注射提供了前所未有的啮齿类动物导管树体内成像。 |
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