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干货分享丨LLC细胞培养与基因编辑实用技巧全解析
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LLC细胞来源于C57BL小鼠肺组织，是经典的高转移、高耐药肿瘤模型，广泛用于肿瘤转移及化疗机制研究。小源带你一站式解锁LLC细胞培养技巧与基因编辑实操关键点！ 一、小鼠肺癌细胞(LLC)基本信息 细胞名称：小鼠肺癌细胞(LLC) 细胞形态：上皮样、圆形细胞混合 细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS 气相：空气，95%；二氧化碳，5% 温度：37℃ 换液频次：传代时换液 传代比例：1:2-1:3 细胞生长状态参考： l 正常状态：细胞形态不均一，上皮样细胞与圆形细胞同时存在，比例不定，均以贴壁状态存在；可能存在少量悬浮细胞。（见下图） l 异常状态： 细胞拉丝或拉长；细胞萎缩、变圆；细胞碎片增多。（见下图） 二、LLC细胞复苏流程 1.准备培养基 取7mL完全培养基于离心管中备用。 2.细胞解冻 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。 3.细胞离心 将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。 4.重悬与接种 用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。 5.细胞培养 将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。 三、LLC细胞传代步骤（以T25瓶为例） 1. 传代条件 l 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代。 l 传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次。 2.胰酶消化 l 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞。 l 将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟。 l 待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化。 3.终止消化 l 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化。 l 然后转移至15mL离心管中。 4.细胞悬液离心 l 1100 rpm 室温离心 4 分钟。 l 离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞。 5.传代培养 l 细胞按照1:2-1:3比例传代。 l 传代第二天观察细胞状态。 四、LLC细胞冻存步骤 1. 收集细胞 按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。 2.离心 1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清。 3.重悬与冻存 用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。 4.降温与储存 将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。 五、LLC细胞培养要点与注意事项 1.细胞状态控制：建议在细胞达到约80%融合度时进行传代，以维持良好生长状态。 2.培养基保存：培养基需避光存放于4°C，并在有效期内使用，确保稳定性。 3.培养环境稳定：保持培养箱温度、湿度及CO₂浓度正常，避免环境波动影响细胞状态。 4.操作温度管理：实验前需将培养基和胰酶预热至37℃，以减少温度变化带来的应激反应。 5.传代操作规范：操作过程中避免剧烈吹打，防止损伤细胞膜；若细胞贴壁分布不均，可轻轻摇动培养瓶使其均匀分布。 6.血清质量选择：LLC细胞对血清品质较为敏感，建议使用高质量胎牛血清培养，以保证细胞正常贴壁生长，避免状态异常。 【小提示】：培养过程中可能会出现少量悬浮细胞。若贴壁细胞为主，可直接弃去悬浮细胞；若悬浮细胞比例较高，可通过离心收集后重新接种至培养瓶中。 六、LLC细胞转染时注意事项 1.细胞状态要求 确保细胞状态良好，使用对数生长期即70-80%汇合度在的细胞。 细胞80%活率＞，可通过台盼蓝进行检测。 使用低代次细胞。 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害。 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。 2.转染试剂与预实验 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。 建议进行药筛预实验找到最佳药筛浓度，以便于转染后进行药筛。 3.电转法 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里。 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化。 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。 进行预实验对电转参数进行优化。 保证电转后细胞≥50%贴壁率。 控制实验时间，电转全程不宜过长。 4.慢病毒法 建议先进行预实验，以确定最合适的MOI条件。 感染前将细胞汇合度控制在30–40%，避免过度生长影响感染效率。 病毒感染前加入助染剂Polybrene，以提高感染效果。 感染24小时后及时更换培养基。 病毒液使用过程中应避免反复冻融，以防活性下降。 若感染效率较低，可考虑进行复感染（前提是细胞对病毒具有良好耐受性），或尝试采用离心感染方式提升效率。 七、LLC细胞铺单克隆实验注意事项 1.细胞状态要求 l 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在60%-70%左右。 l 铺克隆时细胞活率≥80%。 2.试剂与预实验 l 提前预温所有试剂（包括培养基、PBS）。 l 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）。 3.铺板策略 l 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。 l 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。 l 在单克隆培养期间，需要避免频繁晃动，以减少单细胞克隆脱落或迁移的风险。 4.稀释方法 l 使用“极限稀释法”进行铺克隆。 l 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。 源井生物LLC细胞相关产品推荐 源井生物为您提供稳定可靠的LLC细胞，欢迎进入源井·万象全品类细胞库红棉搜索，库内所有人源和鼠源的细胞均可提供STR鉴定报告，保障细胞身份准确；源井生物拥有超 1000 种野生型细胞，覆盖多研究领域，还可提供细胞专用培养基，全方位满足你的科研需求～ 源井生物依托成熟的基因编辑技术和平台，针对该细胞系构建了基因敲除以及Luc、EGFP、Cas9稳转细胞株；还可提供LLC细胞系的基因修饰包括基因敲除、点突变、基因敲入、过表达和干扰等服务，欢迎来了解！   |
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