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WB实验避坑指南！多条带＋高背景？十大原因逐一分析
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1，蛋白存在不同isoform 解决措施:查阅文献，确定研究方向中该蛋白的主流isoform形式，确定蛋白分子量;安排基因敲除等方法确定条带是否为目的带。 2，样本降解 1.反复冻融;2.超声时间过长导致过热降解;3.未添加蛋白酶抑制剂;4.样本保存时间过久或保存不当。 解决措施:重新提取蛋白，分装保存，避免反复冻融;添加蛋白酶抑制剂，如果是磷酸化蛋白，还需添加磷酸酶抑制剂;裂解液应尽可能在-80°C下长期保存;在-20°C下储存时，裂解液的保质期较短，不超过3个月。 3，蛋白上样量过高 解决措施:降低蛋白上样量 4，一抗浓度太高导致出现非特异性结合解决措施:降低一抗浓度 5，二抗浓度过高一般是膜整体背景过高。解决措施:降低二抗浓度。 6，封闭物选取不当 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应。解决措施:磷酸化抗体或含生物素标记的抗体建议用1%BSA进行封闭，不建议使用脱脂奶粉和酪蛋白作为封闭剂，并使用TBST替代PBST。 7.洗膜时间、次数不够 解决措施:增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积，添加Tween-20使其终浓度为0.05%，对于顽固的背景，可以提高NaCI浓度至最高0.5M; 8，显色底物过于灵敏解决措施:降低上样量、一抗和二抗浓度或者选择灵敏度较低的显色底物。显色底物灵敏度建议从低到高选择。 9.封闭液没有完全溶解好解决措施:增加脱脂奶粉或BSA等的溶解时间、封闭液过滤后再使用。 10.二抗浓度过高;封闭不足解决措施:稀释二抗;提高封闭液浓度，或延长封闭时间 |
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