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[交流]
实验前的常见问题与预防措施💭
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1. DNA样本质量问题及预防方法 DNA质量直接关系到酶切效率，这可不是开玩笑的！上个月我们实验室有个小师妹因为DNA样本质量差，重复了整整三次实验都没成功，简直崩溃😭 常见问题： DNA样本中含有蛋白质、RNA或其他杂质 DNA降解严重 DNA含有酚、氯仿等提取试剂残留 预防措施： 提取DNA时严格按照标准流程操作，避免交叉污染 使用新鲜的RNase处理去除RNA杂质 最后一步洗涤务必充分，去除残留试剂 划重点！ DNA纯度A260/A280比值应在1.8-2.0之间，低于1.8说明蛋白质污染，高于2.0可能存在RNA污染！测量浓度时，建议使用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳双重验证样本质量 宝藏建议： 在酶切前先进行DNA纯化预处理！我常用的方法是用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行二次纯化，效果简直不要太好！ 2. 酶活性下降的原因及检测方法 还记得我第一次独立做双酶切实验吗？结果酶切效率极低，后来才发现是酶活性问题，现在我每次实验前都会先检查酶活性！ 常见原因： 酶储存不当，反复冻融 酶过期或质量问题 反应体系中含有抑制剂 检测方法： 使用已知可被该酶切割的DNA进行平行对照试验 检查酶的储存温度记录 查看酶的生产日期和失效日期 划重点！ 限制性内切酶对温度极为敏感！取用时务必放在冰上操作，每次使用后立即放回-20℃冰箱，避免在室温下放置超过5分钟！❄️ 宝藏建议： 我们实验室现在都会做"酶活性月检"，每月用标准底物检测一次关键酶的活性并记录，这样可以及时发现问题酶，避免实验失败 3. 非特异性切割的产生原因及避免技巧 这个问题真的超烦人！上学期我们组有个博士生的克隆实验总是失败，最后发现就是因为非特异性切割导致的！ 产生原因： Star activity（星状活性）：酶在非最适条件下切割非特异位点 酶用量过高，导致降解性切割 反应时间过长 DNA甲基化干扰了酶识别位点 避免技巧： 严格遵循酶供应商推荐的反应条件 精确计算酶的用量，避免过量 控制反应时间，必要时做时间梯度预实验 考虑使用甲基化不敏感的同源酶 划重点！ 高质量限制性内切酶的专一性很高，但在甘油浓度高、pH不合适、Mg²⁺浓度异常时都可能产生Star activity！使用酶时，甘油终浓度不要超过5%！ 宝藏建议： 双酶切时，先用切割效率较高的那个酶进行反应，再用另一个酶，而不是一次加入两种酶！我发现这样可以大大降低非特异性切割的发生概率 4. 污染源识别与防控措施 这是我们实验室的"老大难"问题！有次我们组连续两周的实验都因为污染而失败，最后发现是移液器被污染了 常见污染源： 核酸酶污染，特别是RNase和DNase 实验器材交叉污染 操作者手套污染 试剂污染 防控措施： 使用DEPC处理的水和无核酸酶的试剂 实验前用75%酒精擦拭工作台 定期对移液器进行灭菌处理 勤换手套，避免接触可能含有核酸酶的物品 划重点！ 人手是核酸酶的主要来源！即使戴了手套也要避免用手直接接触反应管内壁、试剂盖等关键部位！ 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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