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实验干货 | 一文学会透免疫荧光实验步骤和图像分析
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实验原理免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术，主要原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。主要包括直接法和间接法。直接法是蛋白和标记荧光素一抗结合，间接法是蛋白和一抗结合，然后再与带有荧光基团的二抗识别，荧光显微镜下即可观察到荧光。 实验步骤（以贴壁细胞为例）流程：细胞爬片→固定→抗原修复（可选）→透化（可选）→封闭→染色→复染→封片→镜检 注意事项： •注意细胞状态和细胞密度，单层细胞生长，密度75%-85%•全程操作记得区分爬片的正反面。有细胞的为正面 •全程操作轻柔，避免洗脱细胞 •加入荧光抗体后后续流程全避光操作 一、细胞爬片 1. 将6孔细胞培养板和多聚赖氨酸处理6孔板配套无菌圆形爬片拿入生物安全柜中 2. 弯型镊子喷适量酒精后用酒精灯消毒，将爬片放入6孔板中（逐片紧挨放入） 3. 沿壁慢慢加入2mL 细胞培养基，用枪头轻轻按盖玻片，使其与6孔板底部紧密接触，不要产生气泡 4. 37度CO2培养箱静置几分钟（期间消化细胞，离心） 5. 用枪头吸干培养基（枪头放盖玻片间隙，最后可将plate倾斜吸干） 6. 沿壁慢慢加入2mL 细胞悬液，轻拍侧壁使盖玻片与6孔板底部之间气泡排出，用枪头轻轻按盖玻片，使其与6孔板底部紧密接触，避免产生气泡，盖玻片之间不能重叠 7. 37度CO2培养箱静置培养约12小时后，观察细胞生长密度，大约75%单层细胞即可开始免疫荧光染色实验 二、固定、抗原修复和透化1. 固定：4%多聚甲醛孵育细胞10min（或者用放在-20℃预冷的甲醇孵育5min）。用提前在4℃或者冰上预冷的PBS洗三次，不要太用力。 2. 抗原修复：（可选步骤）在抗原修复缓冲液对细胞进行加热处理后，有些抗体的效果会更好。 详细流程如下：① 将抗原修复缓冲液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）预热至 95 ℃。 ② 用小型宽头镊子小心将盖玻片置于盖玻片染色缸内的抗原修复缓冲液中，记下长有细胞的盖玻璃面。 ③ 在 95 ℃下加热盖玻片10 分钟。 ④ 从抗原修复缓冲液中取出盖玻片，浸入6孔组织培养板内的PBS溶液中，保持长有细胞的一面朝上。 ⑤ 用 PBS洗涤细胞3次，每次5 分钟。 3. 透化：胞内蛋白需要，膜蛋白不需要。常规透化剂是0.1% Triton X-100 的PBS。透化10分钟然后用PBS洗干净。 三、封闭和免疫染色 1. 用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育细胞 30 分钟，封闭抗体的非特异性结合（替代封闭液可用来源于产生二抗的物种的 10% 血清）。 2. 吸走封闭液，加入稀释后的一抗室温 1 小时。 3. 倒出溶液，用 PBST洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。 4. 用二抗（溶于抗体稀释液中）避光孵育细胞 室温1 小时。 5. 倒出二抗溶液，用 PBST 避光洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。 四、多色染色（可选步骤） 1. 要检测同一个样品中两种或多种抗原的共同分布情况，需要使用双重免疫荧光流程。该流程可在混合物中同时进行检测，也可逐个抗原依次进行检测。 2. 确保抗体来源于不同物种并且这些抗体有相应的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗体和抗抗原 B 的鼠抗体。也可使用偶联至不同荧光团的直标一抗。 五、复染、封片和镜检在样本上滴加DAPI工作液，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟； 用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟； 加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像。 图像分析——ImageJ详细分析流程如下：1. ImageJ打开需要分析的荧光图片2. RGB格式的图像，先提取对应通道，Image-Color-Split channels（ImageJ只能拆成“红绿蓝”三个通道）。如果图像是8 bit，16 bit, 32 bit则直接进行下一步分析3. 调整阈值：Image-Adjust-Threshold，红色区域为统计区4. 设置测量参数：Analyze-Set-Measurements,勾选Area, Mean gray value, Min & max gray value, Limit to threshold  |
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