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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
GST pulldown 实验步骤及结果解读～
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一、实验前准备与样品制备 1.试剂与材料 缓冲液： 裂解缓冲液：50mMTris-HCI（pH8.0），150mMNaC1,1%NP-40（或 TritonX-100），可用并添加新鲜的蛋白酶抑制剂（如 PMSF，Cocktail）和磷酸酶抑制剂（如研究磷酸化相关）洗涤缓冲液：同上但不加蛋白酶抑制剂；为降低背景，可提高盐浓度（如500mMNaCl）或加入 0.1%SDS 洗脱缓冲液：50mMTris-HCI（pH8.0）.20mM 还原型谷胱甘肽；或直接使用2xSDS-PAGE 上样缓冲液。 珠子：谷胱甘肽琼脂糖珠或磁珠。 蛋白样品： 诱饵蛋白：纯化的GST-A（实验组）和纯化的GST蛋白（阴性对照组）。 猎物蛋白：含有目标互作蛋白的细胞裂解液或纯化蛋白 His-B 2.诱饵蛋白准备 表达并纯化 GST-目标蛋白和空 GST 标签蛋白（对照用），分装冻存于-80°C。 3.细胞裂解液制备 培养并收集一个10com圆皿细胞，预冷PBS洗涤细胞两次；加入500L预冷的裂解缓冲液，冰上孵育15-30分钟；用细胞刮刮下细胞，转移至预冷的离心管；4°C，14000g 离心10分钟小心吸取上清（即总蛋白裂解液），测定浓度，分装备用二、Pull-down 核心步骤 4.平衡珠子 轻轻重悬谷胱甘肽珠子，吸取50wL 珠子悬液到1.5mL 离心管中，用1mL 预冷的裂解缓冲液洗涤珠子3次（离心：4°C,500-1000g,1-2min），去除储存液中的乙醇。 5.偶联诱饵蛋白（固定化） 取10ug纯化的GST-目标蛋白和 GST蛋白分别与平衡好的珠子混合；在4°C旋转摇床上孵育1-2小时，使GST与珠子充分结合；离心弃上清，用裂解缓冲液洗涤珠子3次，去除未结合的蛋白；此时，诱饵蛋白己固定在珠子上 6.孵育结合（“钓鱼”过程） 将预清除后的细胞裂解液等量（1mg 蛋白量）加入已偶联了GST-目标蛋白和GST 蛋白的两份珠子中。在4°C旋转摇床上孵育2-4小时或过夜。若猎物蛋白为纯化蛋白，则在此步加入10ug纯化的 His-B 蛋白 三、洗涤、洗脱与检测 7.洗涤 离心，小心吸弃上清；用预冷的洗涤缓冲液重悬珠子，旋转孵育3-5分钟；离心，弃上清； 重复此步骤3-5次。第一次洗涤可温和，后续洗涤可逐渐提高盐浓度或加入低浓度去垢剂以去除非特异结合。 8.洗脱与样品制备 吸尽最后一次洗涤液，直接加入20-40uL 1×或 2×SDS-PAGE 上样缓冲液，涡旋混匀后95-100°C煮沸5-10min（膜蛋白室温变性30min），使蛋白从珠子上变性脱落。 9.检测 将样品进行 SDS-PAGE 电泳； 阳性结果：在“GST-目标蛋白”组中能检测到猎物蛋白条带，而在“GST 空标签”对照组中检测不到或信号极弱。 四、注意事项 蛋白纯化的注意事项 所有操作必须围绕保持蛋白天然构象和生物活性展开。 一、实验设计阶段 表达系统匹配: 大肠杆菌:快速、经济，但无真核修饰，易形成包涵体。 真核系统:可获得正确折叠和修饰的蛋白，但周期长、成本高。 选择依据:下游应用决定。如Pull-down验证可用原核表达:药物靶点研究需真核表达。 标签策略: GST标签:增加可溶性，但可能干扰蛋白功能，纯化后建议切除。 His标签:分子量小，对结构干扰小。 二、操作过程关键点 全程低温:4°C环境操作，缓冲液预冷。 抑制蛋白酶:必须添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物 避免氧化与聚集:添加I-10mM DTT或TCEP(注意  TT会破坏琼脂糖珠，结合前需去除)。 对疏水蛋白，添加0.01%-0.1%非离子去垢剂(如Tween-20)。 彻底去除核酸:细菌裂解液中加入Benzonase核酸酶，减少非特异性结合。 温和洗脱:采用梯度洗脱而非一步洗脱。 收集洗脱峰后立即置于冰上，并快速置换缓冲液(脱盐柱/透析)。 三、质量控制与保存 必须做的质检: SDS-PAGE:验证纯度和分子量。 Western Blot:确认目标蛋白身份。 活性测定:最关键的一步!纯化后立即用功能实验验证(如酶活、Pull-down结合实验)。 分装保存:小体积分装，避免反复冻融。 五、实验结果解读 GSTpull-down实验 GSTpull-down的原理是利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)与谷胱甘肽(GSH)之间的高亲和力，将GST融合蛋白固定在谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上，作为“诱饵”，用于捕获与之相互作用的“捕获蛋白”。此方法常用于体外检测蛋白相互作用 两种Pull-down实验的区别  |
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