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灵思生物金虫 (正式写手)
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[交流]
单细胞转录组测序的样品选择与准备
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确认测序类型：scRNA-seq还是snRNA-seq scRNA-seq（单细胞转录组测序）：侧重于完整细胞的转录组分析，适用于研究细胞异质性、细胞状态和动态变化。 snRNA-seq（单细胞核转录组测序）：适合于处理难以分离的组织或细胞，尤其是在肿瘤和神经系统等复杂样本中，专注于细胞核水平的基因表达研究。 1、根据样本状态：鲜活组织→scRNA-seq/snRNA-seq 冷冻组织→snRNA-seq 2、根据研究目标细胞特征： 重点关注免疫细胞→scRNA-seq 细胞直径大于40um或异形细胞→snRNA-seq 保证能获得高质量细胞悬浮液 样本需保持新鲜，建议组织样本采样后48小时内、血液样本采样后24小时内进行实验操作。 样本处理方法 细胞样本 1、细胞要求建议送样细胞总量≥5×105 cells，活率≥85%，细胞直径为7~30μm。 2、采集与运输悬浮细胞直接吹打混匀，贴壁细胞用0.25% Trypsin-EDTA消化。运输时将细胞悬液保持在2-8℃，2小时内完成后续处理。如需冻存运输，可将106~107个细胞重悬于1mL冻存液中，-80℃冷冻保存后移至液氮中，3个月内复苏。 体液样本 1、样本采集血液样本≥4mL，使用EDTA抗凝管（紫盖）。晨尿≥100mL，收集于无菌容器中。 2、保存与运输血液样本：EDTA抗凝采血管收集，采样后及时颠倒混匀，取样后4℃运输，8h内运送至实验室。如需长途运输，建议采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC细胞，并进行冻存后寄送。尿液：取样后加入5-10%体积比加入细胞保护剂，4℃保存，4h运输至实验室。 新鲜组织样本 1、样本采集新鲜组织：样本量≥200mg（至少黄豆大小）。穿刺组织：≥2条（长度1.5cm，直径≥1.5mm）。 2、保存及运输新鲜组织样本要求全部浸没于预冷的2ml组织保存液离心管中4℃保存，推荐Miltenyi 组织保存液（货号130-100-008），离体48h内冰袋运输至实验室。 3、注意事项实验组与对照组样本的采集状态尽量保持一致；组织较大时，可分割为多颗粒进行保存运输，尽量剔除非目标组织，如多余脂肪、包膜；清洗去除血液残留；手术刀切取，尽量避免化学试剂污染及激光刀、电刀热损伤。 冻存组织样本 1、样本采集冻存组织样本保存时间最好是半年内。 2、保存及运输冻存组织样本可用干冰运输至公司实验室，保证干冰充足，确保样本到达时仍处于冻存的环境。实验室抽提细胞核进行后续的转录组测序分析。 建议：1、肝实质细胞或成熟脂肪细胞细胞较大且容易破裂，肌肉、心脏、脑、神经等组织细胞直径过大超过40μm的，以及冷冻样本，建议选用抽核的方式进行单细胞核转录组测序。其他样本则优先选择做单细胞转录组。 2、胰腺、小鼠肠道等自身容易降解的样本，需注意避免过度清洗，且尽量不要长途运输，尽快消化上机。 3、运输注意保存环境，避免样本降解，可提前联系实验室提供样品寄送服务与指导。 |
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