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科研战神来了新虫 (小有名气)
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干货分享！跑p-AKT蛋白操作流程及注意事项
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一、制样:90%的失败在这儿 1.必加磷酸酶抑制剂 原则: 1现用现加。裂解液配好，加抑制剂，10分钟内用掉。2磷酸酶抑制剂不能反复冻融。分装，50ul一管，用一次扔一管。注意!!!很多实验失败源于:上周或更早配的cocktail放-20°C，反复冻融>3次 2.冰上裂解避雷!有些同学收六孔板，PBS洗两遍，放在室温等下一批AKT磷酸化半衰期几分钟!操作: 1培养皿从孵箱拿出来一立刻放冰上一吸培养基一冰PBS洗一吸干一加裂解液。 2刮细胞:冰盒上刮，别在室温实验台刮。3裂解后立即沸水浴煮样?错!磷酸化蛋白怕热。冰上裂解30分钟，4°C离心，取上清，加loading buffer，然后立刻-80°C冻存。煮样等临上样前再煮，95°C5分钟，别多煮。 3.内参和目的蛋白不能共用一张膜?可以!先孵育p-AKT，正常显影完成后，用抗体剥脱液洗泽后，重新障育总AKT 注意，洗膜需干净，避免磷酸化体和总蛋白抗体竞争同一表位。 电泳与转印:磷酸基团太小了，留不住 1.胶:新鲜配P-AKT蛋白分子量60kDa，胶浓度10%最合适。假如用预制胶，需确保条带分离开，避免压成一条线。配好胶如果不着急用，可泡在4X纯水中暂时隔夜保存，但需避免时间过长会变脆，转膜容易崩。 2.转膜:宁可过转，不要不足p-AKT是亲水性蛋白，从胶性蛋白，从胶里往外跑得慢。 建议:1湿转:300mA，90分钟。冰浴。2半干转:不建议。磷酸化蛋白在半干转体系里容易沉淀在胶面。 3PVDF膜必须甲醇激活>30秒，否则结合效率打六折。 3.丽春红一这是你的质检报告:转完膜染丽春红，两条带:60kD左右一条(AKT)，42kD一条(B-actin)。如果60kD那条明显缺一块域者波浪形，说明胶不平或转膜有气泡一-别往下做了，重跑。但假如，丽春红结:果显示好，蛋白跑不出来，则考虑是一抗/二抗有问题: 三、封闭与抗体:磷酸化抗体是娇气包 1.封闭:避免使用脱脂牛奶脱脂牛奶封闭p-AKT，磷酸基团会被牛奶里的酪蛋白和磷酸酶给竞争掉。 p-AKT封闭考虑用5%BSA，TBST配，或直接使用现成的封闭液如Abmart快速封闭液AWB-6017S，仅需半小时。 2.一抗:我使用的是Abmartp-AKT(货号:T40067S，按稀释度1:1000，4°C封闭过夜，16小时左右最佳。 稀释液:必须是含BSA的抗体稀释液，跑磷酸化避免仅用TBST稀释一抗，24小时后膜上全是点，背景脏成地图。 3.二抗:种属要匹配 P-AKT是兔源，二抗用抗源，二抗用抗兔。别贪便宜买那种大瓶装进口分装，HRP活性三个月就衰减。我用的是Abmart免抗，按照1:5000，孵育二抗室温1小时足够，能，超过2小时背景会比较黑。 四、显影:别以为到这步就稳了 1.曝光时间:秒级才是对的 好的p-AKT条带，曝光5-20秒就应该清晰可见。 需要曝光1分钟以上才有信号一蛋白量太低，或者抗体失效。 一曝光全黑一二抗浓度太高，或者洗膜不干净。 2.显影液:ECL也有磷酸化专用款常规ECL灵敏度不够，磷酸化条带往往弱。建议使用超敏ECL。别舍不得滴，膜铺平，ECL全覆盖，静置3分钟再吸干曝光。 常见问题及解决方案: 现象1:没有条带，内参正常 解决方案: 磷酸酶抑制剂没加/失效 细胞刺激时间不对(胰岛素刺激p-AKT5-10分钟峰值，30分钟就下去了) 一抗稀释度过稀(1:1000起步，别上来就1:3000)一>膜封闭用了牛奶 常见问题及解决方案:现象2:背景高，非特异条带多解决方案: >封闭不够(BSA浓度5%别省)洗膜不彻底(TBST洗5次x5分钟，这是底线 -二抗浓度太高: (1:5000起步，黑得不行就1:10000)一抗孵育温度过高(必须4°C) 现象3:条带拖尾/笑脸解决方案: 一胶浓度太低(10%是最低，有人用8%跑AKT? 蛋白上样量过大(30ug足矣，有人> 上60ug)一电泳产热(跑胶放冰盒里)  |
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