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[交流] 【经验分享】CRISPR基因敲除细胞系构建全流程踩坑指南——从递送方式选择到克隆筛选

前言

稳定敲除细胞系广泛应用于基础机制研究、药物靶点验证以及细胞治疗相关探索，其构建质量与效率往往直接影响课题进展与数据可信度。随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的成熟，基因敲除的技术门槛不断降低，但在实际操作中，从靶序列设计、编辑实施到稳定克隆的筛选与验证，每一个步骤仍存在不容忽视的关键细节。一旦把控不当，极易造成周期延长甚至实验失败。

本文将基于实际操作经验，围绕稳定基因敲除细胞系构建过程中的核心要点进行系统梳理，重点分析CRISPR递送方式的选择策略，帮助科研人员提升成功率、优化实验路径。

一、靶点与基因特性的前期评估

在稳定基因敲除细胞系的构建过程中，前期判断相当于项目启动前的"风险筛查"，其核心目的在于评估目标是否具备可操作性，从源头减少因基因属性不匹配而造成的时间与资源浪费。该阶段主要关注两个方面：目标基因对细胞生存的影响以及其在基因编辑层面的可行性。

1.1 评估目标基因是否影响细胞存活

并非所有基因都适合进行完全敲除。已有研究显示，约有一部分人类基因在细胞生长与存活中发挥关键作用，一旦发生双等位基因破坏，往往会引起细胞死亡或严重的增殖缺陷，从而难以获得稳定的敲除克隆。针对这类潜在风险，可在实验设计前借助公共功能基因数据库（如DepMap），对目标基因的必需性进行预测，同时参考相同或相近细胞系中是否存在成功敲除的报道，以此提高项目的可行性评估准确度。

1.2 梳理基因基础信息

需通过权威基因注释数据库系统梳理目标基因的转录本组成、可变剪接情况及关键功能区域，从而避免靶序列落在非通用外显子上，造成仅部分转录本受到编辑的情况。同时还需关注基因的拷贝状态，对于存在多拷贝的目标，应确保各等位基因均被有效破坏，否则可能残留具有功能的蛋白表达。此外，应结合所选细胞类型对基因递送的敏感性提前评估实验难度，针对原代细胞或干细胞等转染效率较低的体系，需在方案设计阶段就明确合适的递送策略。

二、CRISPR递送方式全景解析

递送方式的选择在很大程度上决定了基因编辑的整体效果，其不仅关系到靶位点的编辑效率，也直接影响潜在的非特异性编辑风险以及实验周期。以下是主流递送方式的系统对比：

2.1 质粒DNA递送

适用细胞： HEK293T、HCT116等易转染细胞

优势：
成本低廉，技术成熟度高
操作简便，无需特殊设备
可通过抗生素筛选实现稳定表达

劣势：
质粒需进入细胞核才能表达，效率受细胞周期影响显著
Cas9持续表达时间较长，增加脱靶风险
可能引发细胞免疫反应

适用场景：
易转染细胞系的初筛实验
机制研究中的快速验证
预算有限的项目

2.2 RNP复合物递送

适用细胞：原代细胞、干细胞、难转染细胞系

优势：
预组装复合物直接进入细胞核，编辑速度快（通常2-6小时即开始切割）
无基因组整合风险，安全性高
Cas9蛋白瞬时表达，脱靶风险显著降低
编辑效率通常高于质粒递送

劣势：
对电穿孔参数敏感，需针对不同细胞进行优化
蛋白纯化成本较高
需要现配现用，储存条件要求严格

适用场景：
高精度编辑需求（如单碱基编辑）
难转染细胞的基因编辑
临床前研究（接近临床递送方式）

2.3 mRNA递送（sgRNA + Cas9 mRNA）

适用细胞：广谱细胞系，包括原代细胞和部分难转染细胞

优势：
平衡效率与安全性： mRNA在细胞质中翻译，不依赖进入细胞核，递送效率通常高于质粒
表达时间窗口可控： Cas9蛋白表达通常维持24-48小时，脱靶风险显著低于持续表达的质粒系统
无基因组整合风险：适合构建稳定细胞系，无随机整合干扰
细胞兼容性好：对多种细胞类型表现出良好的适应性，包括对转染敏感的原代细胞
操作便捷性：相比RNP无需蛋白纯化，相比质粒表达时间更可控

劣势：
mRNA稳定性需要优化递送体系（如使用化学修饰或脂质纳米颗粒）
表达窗口较短，需把握编辑时间点

适用场景：
稳定敲除细胞系构建（首选方案之一）
难编辑细胞的基因操作
需要严格控制脱靶风险的实验
临床前研究（递送方式与临床策略相近）

2.4 病毒递送（慢病毒/腺病毒）

适用细胞：干细胞、原代细胞、极难转染细胞系

优势：
转染效率极高，尤其适合难转染细胞
可实现长期稳定表达，适合功能研究
感染复数度可控，便于调节编辑强度

劣势：
随机基因组整合风险，可能影响细胞表型
病毒制备周期长（通常2-4周）
生物安全要求高，需要相应的实验室资质
免疫原性问题

适用场景：
干细胞、原代细胞的长期功能研究
体内实验（AAV、慢病毒载体）
需要长期表达Cas9的实验体系

2.5 递送方式对比总结
表格
递送方式       编辑效率          脱靶风险             操作难度       时间成本          适用广度             典型应用
质粒DNA          中等                   高（持续表达）低                   短                   中等             初筛、机制研究
RNP复合物高                   低（瞬时）          中                   短（现配）    中                   高精度编辑、临床前
mRNA          高                   低                         低-中                   短                   高                   稳定敲除、难编辑细胞
病毒递送          高                   中                            高                   长（制备）    低                   干细胞、长期研究

三、递送方式选择的决策指南

在实际应用中，可根据不同细胞类型灵活选择递送策略。以下是快速选择决策树：

3.1 快速选择指南

问题1：你的细胞系是什么？
易转染细胞（HEK293T、HCT116、HeLa）→ 质粒或mRNA均可
中等转染细胞（U2OS、MCF7）→ mRNA或RNP优先
难转染细胞（原代细胞、免疫细胞、干细胞）→ mRNA、RNP或病毒递送

问题2：实验目标是什么？
快速初筛验证 → 质粒最经济
稳定敲除细胞系构建 → mRNA或RNP优先
高精度单碱基编辑 → RNP或mRNA
长期功能研究 → 病毒递送

问题3：你能接受多长的周期？
1周内看到结果 → 质粒或RNP、mRNA
2-3周获得克隆 → mRNA
1个月以上（含制备）→ 病毒

问题4：对脱靶风险有多敏感？
高敏感（临床前研究、稳定细胞系）→ mRNA或RNP
中等敏感（机制研究）→ 质粒或mRNA
低敏感（初筛）→ 质粒

3.2 典型应用场景推荐
场景1：构建稳定敲除细胞系 + HEK293T
推荐：mRNA或质粒
理由：细胞易转染，要求编辑效率和可控性平衡，mRNA在保证效率的同时降低了持续表达的脱靶风险

场景2：构建稳定敲除细胞系 + 原代T细胞
推荐：mRNA或RNP
理由：原代细胞转染难度大，mRNA对难转染细胞的兼容性好，且无需蛋白纯化步骤
’
场景3：机制初筛 + HCT116
推荐：质粒
理由：经济高效，快速验证靶点可行性，后续稳定系构建再优化递送方式

场景4：长期功能研究 + 诱导多能干细胞
推荐：病毒递送
理由：干细胞转染难度大，病毒递送可实现长期表达和克隆筛选

四、实际案例分享

案例1：HEK293T稳定敲除构建周期缩短
问题背景：
使用质粒递送系统构建某基因HEK293T稳定敲除细胞系，转染效率达到80%，但连续3个月筛选仍未获得纯合克隆。
问题分析：
Cas9质粒持续表达导致脱靶效应增加，同时部分细胞发生随机整合，影响正常生长和克隆形成。
解决方案：
切换至sgRNA + Cas9 mRNA递送体系
结果：
编辑效率从50%提升至90%
2周内获得3个纯合敲除克隆
脱靶风险显著降低，经全基因组测序验证未发现明显脱靶位点
经验总结：
对于稳定细胞系构建，mRNA的瞬时表达避免了Cas9持续存在带来的脱靶和细胞毒性问题，同时保持了足够的编辑活性，是更优的选择。

案例2：原代免疫细胞编辑效率提升
问题背景：
对原代CD4+ T细胞进行基因敲除，质粒递送效率<5%，RNP递送效率约30%，均无法满足后续功能研究需求。
解决方案：
采用化学修饰的Cas9 mRNA + sgRNA复合物，配合脂质体递送系统，优化mRNA浓度和转染试剂比例。
结果：
编辑效率提升至50%
细胞存活率>80%（RNP方案仅为50%）
成功构建稳定敲除T细胞系，用于免疫治疗相关研究
经验总结：
mRNA递送对难转染细胞的兼容性优于预期，通过合理的化学修饰和递送体系优化，可以在保证细胞活性的前提下显著提升编辑效率。

案例3：多拷贝基因的完全敲除
问题背景：
某靶基因存在4个拷贝，使用质粒递送仅能破坏其中2-3个拷贝，残留蛋白表达影响表型分析。
解决方案：
设计3条sgRNA靶向不同拷贝区域，采用mRNA递送实现协同切割，同时优化编辑时间窗口（延长至72小时）。
结果：
所有4个拷贝均被成功编辑
蛋白表达完全消失
基因型分析显示纯合敲除
经验总结：
对于多拷贝基因，多条sgRNA协同配合高效的递送系统（如mRNA）是实现完全敲除的关键策略。

五、sgRNA设计思路与编辑方案优化

5.1 sgRNA设计核心原则

靶向关键功能域：
优先选择基因编码区（CDS）的前1/3区域，尤其是第一、二外显子
确保编辑后引发移码突变，彻底破坏蛋白功能

控制序列特性：
GC含量维持在30%-70%
避免4个以上连续T碱基结尾
5'端优先为G或GG以提升转录效率
严格匹配PAM序列（SpCas9常用NGG）

降低脱靶风险：
在sgRNA筛选阶段，借助专业设计平台对潜在非特异性切割位点进行系统评估
优先选择特异性评分较高的候选序列
避免靶向重复序列或高度保守区域

5.2 多sgRNA策略提升成功率
实践中，采用多条sgRNA同步设计往往能显著提高编辑成功率。由于单一靶序列可能受染色质结构或局部可及性限制而表现出较低活性，通常建议针对同一基因的不同外显子同时设计2-3条sgRNA，并在细胞群体水平对编辑效果进行初步验证，从中筛选切割效率最优的靶点用于后续克隆构建。
此外，采用双sgRNA联合编辑的方式可诱导目标基因片段的整体缺失，有助于获得更彻底的敲除效果，尤其适用于多外显子基因。

六、单克隆筛选与扩增

在实际操作中，不少研究人员即便已经获得了理想的转染效率和明显的基因切割效果，仍难以成功建立纯合敲除的稳定细胞系，其关键瓶颈往往出现在单克隆分离阶段。由于初步编辑后的细胞群体通常同时包含完全敲除、部分突变以及未发生编辑的细胞，如果仅停留在细胞池（cell pool）水平进行实验，未被编辑的细胞或杂合突变细胞容易干扰表型观察，从而掩盖真实的敲除效应，导致实验结果不稳定。因此，对编辑后的细胞进行严格的单细胞分离并扩增，是获得可靠纯合敲除克隆的必要步骤。

6.1 高效筛选标准化流程

第一步：细胞池富集
转染48-72小时后，通过抗性筛选或荧光报告筛选，淘汰未编辑细胞
提升编辑细胞比例，降低后续筛选工作量

第二步：单细胞分离
有限稀释法：适用于大多数细胞系，操作简单，但周期较长
流式细胞分选（FACS）：效率高，可基于荧光标记分选编辑细胞，适用于难转染细胞

第三步：克隆培养与初筛
单细胞培养2-3周后，对可见克隆进行编号与低代次传代，避免细胞漂移
提取基因组DNA后，通过PCR扩增+Sanger测序，快速鉴定突变类型，筛选纯合敲除候选克隆

6.2 常见问题与解决方案
问题1：克隆形成率低
原因：单细胞分离对细胞造成应激，或细胞系本身生长缓慢
解决：在培养基中添加适当的生长因子（如Rock抑制剂），或延长培养时间

问题2：假阳性克隆
原因：基因型检测时未区分杂合与纯合，或存在随机整合
解决：使用克隆测序技术，明确等位基因状态；结合蛋白层面验证

问题3：细胞表型不稳定
原因：克隆在培养过程中发生回复突变或混合克隆
解决：尽早建立低代次冻存库，定期验证基因型稳定性

七、稳定性验证
要确保基因敲除细胞系真正稳定，需验证其在多代传代后仍保持预期敲除效果，通常从DNA、RNA和蛋白三个层面进行综合评估，以避免假阳性。

7.1 DNA层面
通过PCR扩增靶序列并进行测序，确认纯合敲除基因型保持稳定，无回复突变
对于多拷贝基因，还需确保所有等位基因均被有效编辑
可使用T7E1酶切实验或Surveyor assay快速初筛，但最终需测序确认

7.2 RNA层面
利用RT-qPCR检测目标基因的mRNA表达水平
如出现明显下调且无异常剪接条带，说明突变转录本已被无义介导的mRNA降解系统清除
若发现异常条带，可进一步通过序列比对确认是否存在外显子跳跃产物

7.3 蛋白层面
通过Western Blot验证目标蛋白表达，理想情况是野生型条带完全消失，无截短或融合蛋白残留
必要时可辅以免疫荧光或质谱分析进行进一步确认
注意：蛋白表达结果容易受多种因素影响（如抗体特异性、蛋白稳定性），应综合判断

7.4 长期稳定性考察
在多代传代后（通常10-15代）重复以上验证
同时进行STR鉴定与支原体检测，确保细胞身份正确、无污染
建立低代次冻存库（每5代冻存一次），为后续实验提供可靠材料

八、风险控制与常见误区

8.1 难敲基因的处理
对于某些难敲除基因（如高表达水平、蛋白稳定性强的基因），可采用以下策略：
多sgRNA协同切割
优化编辑时间窗口（延长至72-96小时）
考虑使用高活性Cas9变体（如eSpCas9、HiFi Cas9）

8.2 致死基因的应对
对于必需基因，完全敲除可能导致细胞死亡，可考虑：
构建条件性敲除细胞系（如Cre-loxP系统）
降低表达水平而非完全敲除（如RNAi、CRISPRi）
设计点突变而非移码突变，保留部分功能

8.3 常见误区
误区1：编辑效率高就能获得稳定克隆
现实：高编辑效率是前提，但单克隆筛选和验证同样重要
建议：重视克隆分离环节，确保获得纯合克隆

误区2：细胞池水平验证即可发表数据
现实：细胞池中存在未编辑细胞，表型分析不可靠
建议：必须获得单克隆并进行多层面验证

误区3：蛋白检测阴性即代表完全敲除
现实：可能存在截短蛋白或非典型翻译起始
建议：结合DNA和RNA层面验证

误区4：脱靶风险可以忽略
现实：脱靶可能导致假阳性表型，影响结论可靠性
建议：选择低脱靶风险的递送方式（如mRNA、RNP），必要时进行脱靶检测

九、我们的实践经验与产品方案
在实验室实践中,我们针对不同递送方式进行了大量对比测试,涵盖了从易转染细胞系(HEK293T、HCT116)到难编辑细胞(原代免疫细胞、干细胞)的多种体系。综合比较了编辑效率、脱靶风险、操作便捷性和时间成本后,微界创生特别研发了sgRNA + Cas9 mRNA递送系统,用于解决稳定敲除细胞系构建中的核心痛点。

9.1 传统递送方式的局限
在实际操作中,我们发现传统递送方式存在以下共性问题:

质粒递送的痛点:
Cas9持续表达时间长(通常7-14天),脱靶风险显著
质粒需进入细胞核才能表达,受细胞周期限制大
对于难转染细胞,即使转染效率高,实际编辑效率仍不理想

RNP递送的痛点:
蛋白纯化成本高,批次间稳定性难控制
对电穿孔参数极其敏感,不同细胞需要逐一优化
需要现配现用,储存和运输条件严格
细胞应激反应明显,存活率受影响

病毒递送的痛点:
制备周期长(2-4周),难以快速响应项目需求
随机整合风险,可能影响细胞表型分析
生物安全要求高,需要特殊实验室资质

9.2 微界创生mRNA递送系统的研发思路
针对上述问题,微界创生团队从以下四个维度进行了系统优化:

维度一:编辑效率与细胞兼容性平衡
通过化学修饰优化mRNA稳定性(如假尿嘧啶修饰),延长细胞内半衰期
优化脂质纳米颗粒(LNP)配方,提升难转染细胞的递送效率
针对不同细胞类型建立参数库(电压、mRNA浓度、转染试剂比例),实现快速适配

维度二:脱靶风险控制
Cas9 mRNA在细胞质翻译,表达窗口精确控制在24-48小时
相比质粒持续表达7-14天,脱靶风险显著降低
经全基因组测序验证,脱靶位点数显著低于质粒递送组

维度三:操作便捷性与稳定性
无需蛋白纯化步骤,简化实验流程
批次间差异<5%,实验结果可重复性强

维度四:成本与周期优化
相比RNP,省去蛋白纯化环节,成本降低60-70%
相比病毒,无需制备周期,现货供应,项目启动零等待
优化配方后,单次转染成本控制在合理范围

9.3 适用场景推荐

基于实际应用数据,微界创生mRNA递送系统特别适合以下场景:

场景1:稳定敲除细胞系快速构建(推荐指数:⭐⭐⭐⭐⭐⭐

目标:2-3周获得纯合克隆
优势:编辑效率高,脱靶低,周期可控
适用细胞:HEK293T、HCT116、HeLa等常用细胞系,以及部分中等难度细胞

场景2:难编辑细胞系(推荐指数:⭐⭐⭐⭐⭐⭐

目标:解决原代细胞、免疫细胞、干细胞的编辑难题
优势:细胞兼容性好,存活率高,无需复杂优化
典型案例:原代T细胞、PBMC、iPSCs编辑成功率>50%

场景3:多拷贝基因完全敲除(推荐指数:⭐⭐⭐⭐

目标:确保所有拷贝均被编辑,无残留表达
优势:配合多sgRNA策略,可实现协同切割
典型案例:4拷贝基因3周内实现完全敲除

场景4:低脱靶需求项目(推荐指数:⭐⭐⭐⭐⭐

目标:临床前研究、功能验证需要严格控制脱靶
优势:Cas9瞬时表达,脱靶风险显著低于质粒
典型应用:药物靶点验证、机制研究

场景5:成本敏感项目(推荐指数:⭐⭐⭐

目标:在保证质量的前提下控制预算
优势:相比RNP省去蛋白纯化成本,相比病毒省去制备周期
适用:预算有限但项目紧急的实验室

9.5 如何选择微界创生mRNA系统
如果你有以下需求,可以考虑使用我们的mRNA递送方案:

项目紧急,需要2-4周内获得稳定敲除细胞系

目标细胞为原代细胞、免疫细胞或中等难度细胞系

对脱靶风险敏感,需要严格控制的临床前研究

多拷贝基因需要完全敲除,避免残留表达
希望平衡成本、效率和操作便捷性,选择性价比最优方案

我们的团队有丰富的基因编辑项目经验,涵盖从靶点设计、递送优化到克隆验证的全流程。如果你对特定细胞系的编辑方案有疑问,或者想了解mRNA递送的详细参数,欢迎在评论区留言或私信交流,我们提供技术支持和方案建议。

十、互动与交流
大家在实际构建敲除细胞系时，主要用哪种递送方式？有没有遇到过什么坑？比如克隆筛选困难、脱靶问题、或者某些特定细胞系的编辑难题？欢迎在评论区交流经验！

如果有以下问题，也可以在评论区留言：

特定细胞系的递送参数优化建议

多拷贝基因的完全敲除策略

纯合克隆筛选的最佳实践

不同递送方式的成本对比

我会抽空回复大家的问题，也希望能通过交流互相学习，共同提升实验成功率！

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