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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
关于细胞转染的一些注意事项
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细胞转染指的是将外源核酸（如DNA、RNA、siRNA等）通过物理、化学或生物方法导入真核细胞内，使细胞获得新的遗传特性的过程。目前广泛应用于基因功能研究、蛋白质表达、药物筛选等领域，其效率直接决定了后续实验的成败与数据可靠性。转染效率的高低，不是单一因素决定的。与细胞状态，转染试剂，操作步骤密切相关。那么如何提高细胞转染效率呢?01细胞状态是前提 转染是把外源核酸（DNA/RNA）送进细胞，对于细胞来说属于一种应激。如果细胞本身状态不好，转染效率会显著降低。①传代次数：转染前细胞最好进行细胞传代1-2次，使细胞生长旺盛容易转染，避免使用高传代次数的细胞，代次过高的细胞会出现衰老、形态异常，转染效率直线下降。②细胞状态：使用处于对数生长期（通常50-70%汇合度）的细胞，避免过度生长或状态不佳的细胞。③保证细胞纯净没有污染：支原体、细菌污染是转染的杀手，污染会破坏细胞内环境，导致细胞代谢紊乱，导致转染效率降低。02转染的核酸也是重点 纯度：选用高纯度 DNA 或 RNA（DNA 的A260/A280 比值接近 1.8），可提升转染效率，使用去内毒素试剂盒提取质粒DNA；若转染 siRNA，需全程使用无 RNase 的试剂与耗材，防止 RNA 被酶解降解。浓度：核酸浓度需控制在合理范围：浓度过高易引发细胞毒性，过低则转染效率不足；质粒 DNA 浓度控制在 1000 ng/μL左右，最少大于500ng/μL。03培养条件 血清：血清会降低转染效率，在配制 DNA 与阳离子脂质体试剂的稀释液时，需要采用无血清培养基。这是因为血清中富含大量带负电荷的蛋白质，可与阳离子脂质体或阳离子聚合物竞争结合核酸，干扰转染复合物的有效形成，进而影响转染效率。但是当转染复合物已稳定形成后，在加入细胞前可适量添加血清。双抗：避免培养基中含有抗生素，抗生素会加重细胞应激，尤其是转染后细胞状态较弱，容易导致细胞死亡（转染后24h内尽量不用抗生素）。04操作手法 温柔对待细胞: 加转染复合物时,悬空转圈滴加进入培养皿或者细胞孔板，滴加后轻轻摇晃培养皿打），让复合物均匀分布，但不要剧烈震荡，转染后将细胞放回培养箱培养。正式实验前，一般需要根据说明书，设置一系列梯度对核酸/转染试剂比例进行摸索，选择最佳组合作为后续转染条件。j具体实验步骤按照说明书操作。 |
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