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关于WB实验，你需要知道的蛋白提取步骤
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| 蛋白提取是WN实验中重要的一步，今天分享蛋白提取步骤：【贴壁细胞，以6孔板为例】1.弃去细胞培养瓶或者细胞培养板中的培养基，加入预冷的PBS（去除血清及死细胞等），轻轻地摇晃洗涤，然后去除 PBS。 (注意：整个过程在冰上操作)2.加入PBS，利用细胞刮，也可以使用灭菌枪头，来回刮取细胞，小心吸取并转移至一个空的EP管内。1500 rpm离心5分钟，去除上清。3.加入100-200 μL 预冷的细胞裂解液（磷酸酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：裂解液=1：1：100），(Tip: 如果蛋白浓度不高，可以适当增加蛋白酶抑制剂的浓度).4.冰上裂解30 min后，4℃ 12,000 rpm下离心20min。5.小心吸取上清液至一个新的EP管内，于 -20℃或 -80℃保存待用。【悬浮细胞】1.从细胞培养瓶或者细胞培养板中小心吸取细胞至离心管内，1500 rpm 离心10分钟，去除上清。2.加入预冷的PBS，小心吹打均匀，1500 rpm 离心5分钟，去除上清。3.用滤纸吸干残余的PBS，加入100-200 μL 预冷的细胞裂解液，。冰上静置30 min, 随后，4℃ 12,000 rpm下离心20 min。4.小心吸取上清液至一个新的EP管内，记录吸取量，于 -20℃或 -80℃保存待用。【动物组织】1.从-80℃取出样本，插入冰中，电子天平称量~30-50mg2.将组织放入2mL离心管中，且离心管中放入2-3个小研磨珠。加入300μL裂解液3.使用组织匀浆器（设置研磨参数：60HZ 运行15S，停止30S，重复5次，具体可以根据不同组织设置）4.研磨后会产生大量的泡沫，此时可以放置於4℃冰箱静置15-20min5.4℃ 12,000rpm离心20min,取上清置于新的离心管中，-80℃保存或-20℃保存待用。 |
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