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科研战神来了新虫 (小有名气)
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WB蛋白提取，裂解液该如何选？
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蛋白样品的制备作为WB实验的第一步，也是决定实验成败的关键。很多同学可能会认为样品制备很简单，加点裂解液、煮一煮、上样就完事，对这一步不够重视。当 WB实验失败时，往往是优先考虑调整操作条件，而忽略了最根本的源头——蛋白样品的质量。但一次成功的 WB，七分靠样品，三分靠操作。如果在起始步骤蛋白样品就已经降解或丢失，那后续无论怎么优化条件，都难以获得可靠的结果。今天这篇文章，我们就来盘点一下蛋白提取过程中，裂解液该如何选？ 首先我们来看看裂解液是如何发挥作用，让样品中的蛋白跑到溶液中的？一般来说，我们现在实验室里用到的裂解液成分主要是：去垢剂+缓冲体系+盐离子，去垢剂决定了裂解液的裂解能力，是整个裂解液中最核心的部分。 当去垢剂浓度达到一定程度时，它们会竞争性地取代原本包裹在膜蛋白周边的磷脂双分子层。膜蛋白通常含有疏水的跨膜区，去垢剂的长尾巴会附着在蛋白的疏水区，保护其不被极性的水环境排斥。 膜蛋白完全被去垢剂分子包裹，形成了一个球形的“胶束”结构。在这个胶束中，去垢剂的疏水尾部向内紧贴蛋白，亲水头部向外接触水环境。这样，原本不溶于水的膜蛋白就变成了“水溶性”的，能够稳定地存在于裂解液的上清液中。 根据去垢剂的类型和裂解强度，我们通常将实验用到的裂解液分为三类：温和型（非变性）、中等强度型和强变性型。在操作之前我们需要停下来，花几分钟思考：“我的目标蛋白是什么类型？它位于细胞哪个部位？是否带有易丢失的修饰？”因为这几个问题决定了我们裂解液的选择。 温和型（非变性）裂解液这类裂解液以 NP-40 或 Triton X-100 等非离子型去垢剂为主，能够有效溶解细胞质膜，充适合可溶性胞质蛋白和膜结合蛋白，能最大程度保持蛋白质的天然构象及蛋白–蛋白相互作用。但如果你的目的蛋白是像组蛋白、细胞骨架等难以从细胞中释放的蛋白，那可能就需要选择中等或强变性裂解液来提高蛋白提取率。 中等强度型裂解液中等强度裂解液，即“中度变性”或“部分变性”，以 RIPA为主。我们在实验室中，最常用的也是RIPA裂解液，它能高效提取多种类型的蛋白，广泛用于Western blot。市面上的RIPA裂解液配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以再细分为强、中、弱三类。强RIPA裂解液适用于难溶蛋白、核蛋白、膜蛋白；中等强度 RIPA 裂解液是我们最常用的，适合大多数常规的WB实验，它能在保留部分蛋白天然构象的同时，仍具有较强裂解能力；弱RIPA裂解液的作用接近于非变性裂解液，适用于蛋白互作研究及功能性蛋白复合物的分析 强变性型裂解液这一类裂解液以SDS为代表，它能够完全变性蛋白，破坏所有高级结构和相互作用，溶解能力极强，适用于提取难溶蛋白、包涵体以及高度疏水膜蛋白。使用这类裂解液的时候需要注意，由于强变性裂解液提取效率比较高，因此提取得到的蛋白样品浓度往往也会高于前两种条件，因此，在后续电泳上样时要注意控制上样量，避免因为过度上样导致条带拖尾、弥散。  |
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