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用于快速血管内止血的含钽微粒的纳米复合水凝胶
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介绍 抗凝治疗(ACA)中的出血是一种严重的内科急症，具有高发病率和高死亡率仅在美国，就有超过2300万人在ACA上出现心房纤维性颤动。每年有超过3000万份coumadin的处方，新型口服抗凝剂的处方也在增加；仅香豆定的出血频率估计为每年15-20%。使用机械瓣膜和心脏辅助装置(CAD)的患者出血风险更高。事实上，高达40%的冠心病患者会出现消化道出血(GIB)。这些患者胃肠道出血的最常见原因是炎症、血管畸形或与创伤相关的病因。如果因另一种严重疾病住院期间发生出血，GIB死亡率会急剧增加至4倍，如果是复发性出血，死亡率会增加10倍。经导管动脉栓塞已成为治疗出血最安全、最有效的方法之一。 血管内栓塞治疗血管出血包括反复将线圈状金属线推入动脉，直到它们紧密堆积，以减缓血液流动和凝结。然而，弹簧圈栓塞与高再出血率、不可预测的经济性相关，最重要的是，它们依赖于患者形成血栓的能力。当患者进行抗凝或凝血治疗时，这些问题会加剧。报道了一种用于凝胶栓塞材料(Ta-GEM)的新型生物工程化载钽纳米复合水凝胶，其可使用临床导管快速递送，用于即时止血，而不管凝血状态如何。Ta-GEM制剂可通过大多数临床可用的成像方式(包括超声、计算机断层扫描、磁共振成像和荧光透视)观察到，没有明显的伪影。此外，Ta-GEM可回收，允许暂时血管闭塞，并可用于抢救线圈栓塞失败的病例。发现在猪模型中Ta-GEM闭塞一级动脉如肾动脉和髂动脉是安全和持久的；到第28天时，动脉腔中75%的注射Ta-GEM被致密结缔组织取代。总的来说，这项研究表明Ta-GEM比目前的技术有许多优势，在临床实践中有潜在的应用。 实验 开发Ta-GEM以提高可见性 临床上，今天用于栓塞的金属线圈在荧光镜检查中是可见的；然而，它们与CT成像、MRI和US一起产生显著的伪影。由于人为因素，栓塞后无法评估介入治疗的结果，这是当今临床实践中的一个重大挫折。因此，我们测试了一种Ta-GEM配方，这种配方允许在所有成像模式下进行材料和局部解剖可视化，包括CT、MRI、US和荧光透视，而没有明显的伪影。 为了提高GEM的可视性，我们将注意力集中在Ta微粒上，因为它已经在各种医疗器械中临床使用。Ta已被用作碘化剂的替代造影剂，因为它在生物学上是安全的，并通过尿液排泄。 使用SpeedMixer将平均尺寸为2 μm的Ta微米颗粒或尺寸< 25纳米的Ta纳米颗粒与GEM混合，形成Ta-GEM(例如，2–30% w/w的Ta-GEM)。CT体模研究(图1A，B)表明，混合了20%钽的宝石产生了令人满意的可见度，没有任何条纹伪影。荧光实验表明，纳米钽不能均匀地分布在整个宝石中，导致可视性差；因此，随后的实验在GEM中使用了微米尺寸的Ta颗粒(图1C，D)。 为了测试Ta-GEM在体内的可视性，在超声引导下使用21 G针头经皮进入猪肝的肝静脉；实时地，在Ta-GEM注射期间进行US和荧光成像，显示足够的可见度(图1E，F；白色箭头表示两幅图像中的相同区域)。 用多种成像方式评估宝石可见度。a)显示了八个注射器的CT轴位图像，这些注射器在模拟人体胸部的模型中装有0-30% Ta-GEM；b)与30% Ta-GEM或50%碘海醇-GEM (n = 4)相比，20% Ta-GEM(黄色虚线轮廓)显示出相似的Hounsfield单位。c，D)装载有含有10%碘海醇、20% Ta纳米颗粒(纳米Ta)或20% Ta微粒(微米Ta)的GEM的注射器的荧光图像；d)荧光透视图像上平均像素强度的定量显示20%的微Ta产生足够的强度(n = 4)；包括50%碘海醇作为对照，因为这是临床上使用的浓度。e，F)在使用20% Ta-GEM对猪进行经皮肝静脉栓塞期间，同一区域(箭头)的超声和荧光图像。g)含有0–30%钽微粒(n = 3)的宝石剪切波弹性成像的图解总结。h)填充有20% Ta-GEM的注射器的标准T1和T2 MRI的横断面视图，显示T1序列的衰减和T2序列的明亮信号。I)相对于MRI模型(箭头)计算肌肉和肝脏的T1和T2信号强度。相对于在(I)中计算的信号，20% Ta GEM的T1和T2信号在图中示出；这些表明Ta-GEM的信号强度大于肌肉或肝脏，表明它将通过MRI可见。l)20% Ta-GEM的扫描电子显微镜(白色箭头，Ta微粒)。数据为平均值±标准差(**p < 0.01，***p < 0.001，***p < 0.0001)。 Ta-GEM的可注射性及剪切稀化性能分析 为了确定向GEM中添加Ta的效果，使用压缩试验(图2A)检查了GEM和Ta-GEM通过2.8 French (110 cm)和5 French (100 cm)临床导管的可注射性。在这两个系统中，Ta-GEM显示出与GEM相当的可注射性，表明添加Ta颗粒确实增加了注射力，但这些变化并未显著影响可注射性(2.8法国导管，图2B，C；5法国导管，图2D，E)。接下来，我们研究了中断交付的影响；再次观察到对注射力没有显著影响(图2F)。进行间歇给药并实时评估栓塞的能力是一个重要的特性；目前的技术不可能做到这一点。 除了可注射性之外，Ta微粒对GEM机械性能的影响通过流变学研究进行分析。GEM和Ta-GEM的流动曲线显示了相似的剪切变稀特性(图2G)。为了评估GEM和Ta-GEM的爆炸强度，我们进行了振幅振动试验来测量它们的储能模量G′和损耗模量G″。图2H证明了GEM和Ta-GEM都是粘弹性的，它们的G′值约为G″的10倍。此外，与GEM相比，在Ta-GEM中没有观察到G′(在0.1%应变下测量)的显著变化(图2I)，这表明Ta对GEM的机械性能影响最小。这些结果表明，GEM和Ta-GEM的栓塞强度相当。 钽宝石的物理机械特性。a)注射力测试示意图。表中显示了测试过程中使用的导管和参数(内径:导管内径)。b)在1 cc注射器中，通过110 cm、2.8F微导管以1mL min-1注射GEM和Ta-GEM的代表性注射力曲线。c)2.8F微导管系统中GEM和Ta-GEM的松脱力和注射力的总结(n = 5)。d)GEM和Ta-GEM的代表性注射力曲线，分别装入3 cc注射器，通过100 cm、5F导管以2ml min-1注射。e)总结5F导管系统中GEM和Ta-GEM的松脱力和注射力(n = 5)。f)Ta-GEM通过5F导管以2ml min-1的速度间断输送(输送10 s，然后停留5 s)的注射力曲线。g)比较GEM和Ta-GEM在37℃下的流动曲线，显示剪切变稀特性。h)GEM和Ta-GEM在37℃下的振幅扫描。I)GEM和Ta-GEM在25和37℃下的储能模量动力学总结(n = 3)。数据是(C)、(E)和(I)的平均值±标准差。 评价Ta-GEM的血栓形成性、稳定性和无菌性 Ta-GEM的增强的血栓形成性是实现血管闭塞的栓塞剂的有利特性。将与Ta-GEM混合的柠檬酸化人血的等分试样中的血液凝固与用于患者的标准线圈进行比较。当与单独的血液相比时，线圈、GEM和Ta- GEM都表现出促凝特性；然而，当测量凝块的质量时，与单独的GEM和血液相比，Ta-GEM在3分钟时质量开始显著上升(图3A，B)。这些结果表明Ta-GEM具有增强的凝块形成特性，这可能进一步稳定血液-GEM界面的栓塞材料。 为了证实Ta-GEM的栓塞能力，进行了体外栓塞实验(图3C–E)。GEM和Ta-GEM的位移压力相似(35.8 3.9和33.2 2。G kPa，分别为；p = 0.5)，但明显高于单独线圈(9.9±1.5千帕，p < 0.0001)。更重要的是，当Ta-GEM与线圈结合时，置换压力可达234.5±21.4 kPa，几乎是人体标准生理收缩压的15倍。GEM与线圈组合的额外强度可能是由于Ta颗粒和线圈之间的摩擦增加。我们进一步评估了Ta-GEM的稳定性(图3F，G)和无菌性(图3H)。 Ta-GEM的血液血栓形成性和无菌性评价。a)与GEM、20% w/w Ta-GEM和市售纤维线圈混合的血液形成血栓的时间。b)与单独的血液或单独的GEM相比，Ta-GEM随时间显示出增强的血栓形成性的所形成凝块的平均质量。c)体外栓塞试验中的阻力压力曲线。d )( C)中数据的图表总结显示，与单独线圈相比，Ta-GEM +线圈产生的峰值压力最大(**p < 0.01，***p ≤ 0.001，***p < 0.0001，数据代表平均值SD，n = 3)。e)带有和不带有GEM(绿色)的血管模型内的纤维线圈的照片。在D0、3、7、14、28和70，使用微型CT扫描仪对试管成像，并进行图像分析；显示了管的冠状视图，白色亮点代表Ta。在多个水平的轴向视图中计数Ta微粒的数量，并以(G)表示。使用单向ANOVA、Tukey的多重合作检验(ns:不显著)进行统计分析。h)将GEM和Ta-GEM混合在LB肉汤中并在37℃下培养7天的无菌试验的图解总结；接种了大肠杆菌的LB肉汤用作阳性对照。在600 nm处测量每个等分试样的光密度。结果是平均值±SEM(* * p < 0.01，* * * p < 0.0001n = 4)。 Ta-GEM栓塞猪髂动脉的疗效:非存活模型 基于可视化、机械测试和共凝固测试的结果，我们研究了Ta-GEM栓塞剂的疗效猪的动脉系统。实验旨在评估Ta-GEM与弹簧圈在极度抗凝状态下一级动脉栓塞中的性能。使用临床工具和成像设备，使用导线和导管的组合将导管尖端输送至远端腹主动脉。数字减影血管造影术(DSA)显示了主动脉分成成对的髂外动脉和髂内动脉的特征性分裂。在静脉注射20-30000单位肝素以达到ACT >300 s后，插入一条髂动脉；随后，通过5 French Bernstein导管或2.8 French微导管使用Ta-GEM对约G–7cm的髂动脉进行栓塞(图4；图4A–D和电影《S1与S2 》(支持信息)展示了Ta-GEM在体内和尸检时的实时释放。 非靶向栓塞一直是栓塞术中关注的问题程序。作为一种安全机制，我们评估了Ta- GEM在意外或偶然的非靶栓塞事件中是否可以回收。5例患者使用Ta-GEM栓塞髂动脉；长达3小时后，使用半影抽吸导管系统(一种用于中风血栓切除术的常见装置)成功取出全部Ta-GEM。这些结果表明Ta-GEM是可以回收的；也第一次表明，临时栓塞可能是一种可能性，例如，在血管创伤患者中，可以回收Ta-GEM以恢复正常血流。 抗凝猪髂动脉GEM栓塞的评价。a–C)。显示了Ta- GEM注入髂动脉期间的系列数字减影血管造影术(DSA)图像(有关实时视频，请参见电影《S1 》,支持信息)。这些图像显示了从导管尖端(箭头)退出时的即时堵塞，而没有远端碎裂。d)尸检显示含有Ta-GEM的髂动脉(箭头)。e) DSA显示线圈未能实现闭塞(黑色箭头；造影剂流过动脉内的线圈块)。对侧髂动脉的白色箭头显示动脉被GEM完全闭塞。f)髂动脉中的造影剂注射显示造影剂流过线圈块(黑色箭头)并超出线圈块(白色箭头)。在(f)中将Ta-GEM输送至线圈块后,( G)中的DSA图像显示完全闭塞(黑色箭头),无突破性血流(白色箭头)。h )( G)的冠状微CT图像显示Ta-GEM(箭头)均匀地铸造了髂内动脉，没有伪影；相反，线圈块(箭头)产生明显的条纹伪影，限制了对动脉和邻近分支的评估。I–K)代表髂内动脉的图像，最初用Ta-GEM栓塞，后来用半影抽吸导管取回(黑色箭头)。k)动脉栓塞后3小时取出GEM ≈后恢复血流。 Ta-GEM栓塞猪髂动脉的疗效:长期存活模型 我们研究了使用Ta-GEM栓塞猪髂动脉的长期结果，同时接受每日抗凝抗血小板治疗。栓塞术后存活28天，对动物进行对比增强CT血管造影(CTA ),然后实施安乐死。所有1G的动物在每个时间点都表现出持续的栓塞，在CTA成像中没有非靶栓塞的证据 通过计算机断层扫描和组织学评估猪髂内动脉闭塞。A)分别用H&E、VG弹性蛋白、Masson三色和髓过氧化物酶(MPO)对栓塞后0、7、14或28天的一组显微CT图像及其相应的组织学上的髂内动脉横截面进行染色。在第0天，用GEM(箭头)均匀闭塞动脉。随后，发生同心纤维炎症反应，导致宝石的生物降解。b)显示了在每个时间点分割每个血管内的GEM之后，外植猪髂内动脉的重建高分辨率微CT扫描的3D冠状渲染(箭头指向GEM，动脉内为黑色；结缔组织被描绘为灰色)。随着时间的推移，GEM逐渐生物降解，纤维化增加(灰色)。c)主动脉至髂动脉的重建线性描绘，显示左髂内动脉内的Ta-GEM(箭头)和未闭的右髂内动脉(箭头)。d)来自(B)中的微CT分割数据集的Ta-GEM随时间的定量显示为揭示动脉内Ta-GEM进行性减少的图。使用ANOVA和Tukey的事后分析，数据是n = 4，* p < 0.0001，** p = 0.007的平均SEM。 Ta-GEM栓塞猪肾动脉的疗效:评估再通的急性和长期存活模型 髂动脉栓塞证明Ta-GEM是稳定的，可持续闭塞超过28天，由于栓塞的髂动脉远端的CT图像显示有对比增强，所以不能肯定地排除栓塞的动脉段；这可能是由于跨盆腔侧支血流绕过了栓塞段。为了评估随着时间的推移Ta-GEM再通的可能性，对1G猪的主要肾动脉进行栓塞。肾脏由终末器官动脉组成；主肾动脉的成功栓塞应该导致肾的远端缺血和均匀萎缩。然而，Ta-GEM的任何再通都会导致血流的恢复和萎缩的减少或消失。此外，由于肾动脉是终末动脉，可使用Ta-GEM栓塞的最小血管也通过组织学确定和证实。 使用5号法国Cobra导管，对主要肾动脉进行了导管插入术，并通过DSA成像进行了确认(图6A)。随后，注射2–3毫升Ta-GEM，导致动脉和闭塞的即时铸造(图GB)。使用Cobra导管从主动脉进行的DSA成像始终显示肾动脉完全闭塞。就在尸检之前，使用临床CT扫描仪进行成像(图GC–E)；这些结果表明，在28天的研究期间，栓塞的肾脏没有血流，并出现进行性萎缩。到第四周，栓塞的肾脏显示出肾脏体积持续减少约4倍。而栓塞的肾动脉或任何远端动脉段没有任何血流(图GF–K)；这些数据，包括广泛的CT图像分析，表明不存在血管再通。 Ta-GEM栓塞猪肾动脉及其与明胶海绵的比较。a，B)使用Ta-GEM进行肾动脉栓塞前后的荧光图像；注射2–3毫升Ta-GEM后，完全没有肾动脉血流流向肾脏(箭头)。c)最大强度投影图像显示用Ta-GEM(箭头)闭塞的左主肾动脉和节段性分支。d)轴位CT和E) 3D重建图像显示明显萎缩的肾脏，肾动脉内有Ta-GEM。f–I)分别在第0、1、2或4周使用Ta-GEM栓塞肾脏的代表性冠状图像。肾皮质缺乏钽宝石。j)显示对侧肾脏代偿性肥大的尸体剖检后4周栓塞肾脏的大体外观的照片。k)肾动脉栓塞后总肾体积测量值的总结(***p < 0.001，***p < 0.0001，采用单向方差分析，每组n = 4)。使用明胶海绵栓塞肾动脉之前和之后的DSA图像(黑色箭头)。n)在栓塞后两周，轴向CT图像显示尽管肾动脉栓塞成功，但栓塞的肾脏和动脉中的血流增强(黄色虚线轮廓)。随着时间的推移，肾脏逐渐萎缩。数据以平均值SEM报告。 结论 在过去的几十年里，经导管栓塞术取得了巨大的发展。例如，大多数脑动脉瘤、非创伤性和一些创伤性出血以及消化道出血的治疗已经从开放式手术治疗转变为弹簧圈栓塞治疗。在这里，我们展示了一种用于GEM的新型组合物，由明胶、纳米硅酸盐和Ta微粒组成，具有剪切稀化特性，允许使用标准临床导管输送。Ta-GEM具有类似于线圈的血栓形成特性，可以灭菌，并且可以在超声波、CT、MRI和X射线透视下可视化。它的置换压力比收缩压大很多倍，当与线圈结合时，置换压力超过1G00 mmHg。在猪体内，Ta-GEM可在输送至一级动脉的过程中实时显示，使用临床导管实现即时栓塞，其部署速度比线圈快40倍，且Ta-GEM保持在原位，不会碎裂或移位。Ta-GEM的动脉闭塞是持久的，没有任何再通的迹象；Ta-GEM在猪体内的生物降解很快，四周后仅剩余25%。在猪肾中Ta-GEM不会到达静脉循环。此外，Ta-GEM是安全的，在标准实验室测试、细胞因子阵列分析和CT成像中没有毒性证据。 |
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