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钽纳米颗粒增强明胶水溶胶复合材料的成骨诱导性
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介绍 可生物再吸收的聚合物材料作为骨组织再生的植入物已经引起了极大的兴趣，因为它们相对于传统的金属装置显示出显著的优点，包括可生物降解性、柔韧性和易于改性引入的可能性。 骨损伤可以由几种病理条件产生，当它们超过骨自愈能力的临界尺寸时，需要外部干预来促进骨再生和恢复正常的骨功能。由于人口老龄化，对骨组织愈合和再生的新策略和先进材料的需求逐年增加。由合成聚合物制成的骨引导再生装置，包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)及其共聚物聚丙交酯-共-乙交酯(PLGAs)，代表了骨组织工程和骨替代物的令人鼓舞的解决方案，其特征和要求已在许多综述论文中指出。良好的生物相容性、适当的机械性能、易于加工、合适的降解速率和优异的骨传导能力是这类聚合物的主要特征。 钽以多孔植入物的形式用于骨科应用，被证明具有生物活性、骨诱导性，并且能够比钛植入物更好地支持人类成骨细胞的生长和分化。钽纳米粒子目前被用作X射线计算机断层成像的纳米探针和药物输送目的。 实验 材料 聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)，PLGA，(丙交酯:乙交酯=75:25，Mw=76000-15000 Da，RESOMER RG 756 S)；聚乙二醇，PEG，(Mw=1500 Da)；来自猪皮的A型明胶(300 Bloom，适马奥尔德里奇)。钽纳米颗粒(平均颗粒尺寸= 50-80 nm，纯度> 99%)。二氯甲烷(DCM)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。 静电纺丝垫的制造 将PLGA以20% w/v的浓度溶解在DCM/DMF (70/30 v/v)中，并在室温(RT)下搅拌15分钟。将PEG以65% w/v的浓度溶解在双蒸水中，并在室温下搅拌15分钟。制备并电纺四种不同的溶液，其重量比PLGA/PEG = 100/0、95/5、90/10、80/20。 获得厚度在50-70μm范围内的垫子，并在干燥器中储存过夜以除去残留溶剂。 水凝胶的制备 考虑了两种不同的明胶基溶液  I)“明胶溶液”，含有A型明胶和京尼平，用作交联剂，和(ii)“明胶-钽分散体”，除明胶和京尼平外，还含有钽NP。水凝胶/纤维复合支架的制备 PolyGelTa水凝胶/纤维复合支架的制造过程如下：将42℃下的“明胶-钽分散体”( 8 mL)倒入皮氏培养皿(内径= 5.4 cm)中，并在4℃下保持5分钟以形成凝胶。然后将从垫子上切下的直径为5 cm的电纺样品放在明胶层上。 将另外8毫升42℃的“明胶-钽分散体”倒在电纺垫上，并将所得材料在4℃保持24小时。在室温下在层流下蒸发溶剂24小时后，从溶剂浇铸法获得支架。使用“明胶溶液”代替“明胶-钽分散体”,按照相同的程序生产PolyGel复合支架。 表征方法 使用TA Instrument TGA Q500分析仪从室温至600℃对电纺垫进行热重分析(TGA ),在N₂气氛中以10 ℃/ min的加热速率进行。使用TA Instruments Q100 DSC装置，在-90℃至120℃的N₂气氛中，以20℃/min的加热扫描速率，对电纺毡进行DSC测量；在第二次加热扫描中，在玻璃化转变热容阶跃的一半高度处获取Tg。 溶胀度和明胶释放的测定 将复合支架在磷酸盐缓冲液(PB，0.1 M，pH 7.4)中浸泡1分钟至300分钟后，测量膨胀度。用滤纸擦拭湿样品以除去多余的液体。根据等式计算膨胀度（其中ww和wd分别是湿样品和风干样品的重量）。对于明胶释放的测定，将100 mg复合支架浸入37℃的5ml PB中。 体外测试 为了评估材料的生物安全性，第一个评估是细胞毒性测试，通过实验材料和人成骨细胞样细胞之间的直接接触在较短的实验时间(72小时)内进行。使用了阳性和阴性对照。在评估阴性细胞毒性后，在生物材料上培养人类间充质干细胞达14天，进行生物活性的体外模型。 细胞毒性试验:在补充有10% FCS和抗生素(100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)的DMEM培养基中培养人成骨细胞样细胞MG63。通过胰蛋白酶消化从培养瓶中分离细胞，并通过台盼蓝染料排斥试验检查细胞数量和生存力。 生物活性测试-体外模型:在MSCBM(添加了生长试剂盒的基础培养基，ATCC)中扩增第2代的正常人骨髓来源的间充质干细胞。传代后，对细胞进行计数，并以3×10⁴细胞/mL的浓度接种在含有PolyGel和PolyGelTa无菌样品的24孔板中。 生物活性测试-细胞活力和形态学:在第3、7、10和14天进行评估，以评估生物材料和CTR上的细胞活力和hMSC活性。通过WST1试验测量生存力，通过活/死试验观察细胞形态。 生物活性测试-基因表达:通过评估所有组中最常见的成骨细胞分化标志的基因表达来研究生物活性。 结果与讨论 这项工作的基本原理是制备创新的可吸收的聚合物支架，该支架可能适用于骨组织再生的框架。通过将PLGA电纺毡的柔韧性和抗水解性与京尼平交联的明胶的仿生特性和钽的优异生物活性和骨诱导特性结合起来。 该复合支架由两个用京尼平交联并填充钽纳米颗粒的明胶水凝胶外层和一个PLGA内层电纺纤维（作为增强组分）组成，表示为PolyGelTa。还制备了具有相同几何形状但没有钽NP的相同支架(PolyGel)。复合支架的制备根据实验部分中报道的程序进行。简而言之，它包括(I)将电纺垫放置在从含有钽NPs(明胶-钽分散体)的明胶/京尼平溶液获得的水凝胶层的表面上，(ii)在42℃下将第二层明胶-钽分散体倾倒在电纺垫上，(iii)将获得的材料在4℃下储存24小时。 电纺毡的形态学分析显示，浓度为5%、10%和20% (w/w)的PEG的存在没有显著影响纤维直径(PLGA/PEG0为(0.91±0.16)μm，PLGA/PEG5为(1.16±0.22)μm，PLGA/PEG10为(1.28±0.21)μm，PLGA/PEG20为(1.32±0.20)μm)，并且所有的垫都显示出多孔结构以及光滑和无珠的随机取向纤维。通过热重分析(TGA)进一步证实了PEG的存在，这使得能够根据约350℃下的重量变化来定量PEG的量，归因于PEG链降解  LGA/聚乙二醇20为13重量%，PLGA/聚乙二醇10为7重量%，PLGA/聚乙二醇5为4重量%，与饲料相当接近。通过使用PLGA/PEG0纤维制造的PolyGelTa的横截面视图显示水凝胶对垫的浸渍差，从而证实了相关发现。 层析分析强调了在PolyGelTa水凝胶层的整个厚度和表面上存在良好分散的钽NP，缺乏与化学物质一致的相关骨料（通过EDS进行表征）。此外，分析的分布沿着水凝胶层厚度的纳米颗粒证明它们是良好的分布，突出了水凝胶防止它们聚集的有效性。这一结果可以通过明胶链稳定钽纳米颗粒的静电相互作用来解释。事实上，这项工作中使用的A型明胶的等电点pH值为8.4，意味着生物聚合物在复合制剂条件下带正电(测量的pH= 7.2)，而钽NP在该pH值下可能带负电荷。由于钽纳米颗粒的存在，与PolyGel相比，PolyGelTa观察到明显更高的粗糙度，这可以排除聚集体的存在（典型的供应钽NPs特征）。粗糙度已被记录为显著影响细胞行为和性能：细胞优先在粗糙表面上粘附、扩散、迁移和增殖，优于光滑表面。考虑到这一点，含钽纳米颗粒的复合支架应该代表骨细胞居住和功能以及骨基质形成的更好环境。 PolyGel和PolyGelTa在PB中的膨胀和明胶释放曲线结果显示了相关的溶胀特性和明胶释放规律。 由于新的复合支架是为骨组织接触而设计的，因此MG63成骨细胞样细胞系用于细胞毒性试验。通过测量细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放来进行细胞毒性的定量评估。细胞生存力被认为是评估的基本参数，因为生存力降低超过30%被认为是细胞毒性效应。培养3天后的细胞生存力结果显示PolyGel和PolyGelTa的值与CTR没有差异。 为了研究PolyGel和PolyGelTa作为细胞生长和维持分化的支持物的能力，在验证了骨髓来源的间充质干细胞(hMSC)向成骨细胞谱系分化的能力后，选择了它们。细胞培养分别通过活/死以及茜素红染色，比较基础培养基和分化培养基的细胞生存力和矿化能力。两种染色都证明了分化细胞和未分化细胞之间的差异，如形状和方向以及钙沉积。 为了研究支架在诱导和支持快速细胞建群中的潜力，在PolyGel和PolyGelTa上培养的hMSC的存活力和生物活性在培养的第3、7、10和14天进行评估。将结果与分化培养(CTRd)和未分化培养(CTRnd)进行比较。当与CTRd(在每个实验时间的PolyGel，在3、10和14天时的PolyGelTa)相比时，在生物材料上生长的hMSC显示出较低的增殖，但是生存力的百分比总是超过70%，证实了不存在细胞毒性。活/死染色也证明了hMSC粘附并生长在PolyGel和PolyGelTa样品上，显示了生物材料表面的规则形态和完全定殖，图像与WST1值一致。 CTRd和CTRnd之间的比较表明，当在合适的条件下培养时，hMSC能够分化：除了在7天时BGLAP和CtSP7的值暂时较低之外，CTRd的所有实验时间的所有研究参数的结果都较高，并且与CTRnd显著不同。PolyGel、PolyGelTa和CTRd在培养14天的CTRnd的函数（认为是1）结果显示，所有观察到的基因表达都被PolyGel培养物高度增强。 结论 在这项工作中，开发了一种创新的水凝胶/纤维纳米复合材料支架，该支架在骨组织再生应用中表现出令人感兴趣的特性，如柔韧性、生物可降解性、生物相容性、仿生性和骨诱导性。 材料表征强调了纤维垫被水凝胶很好地浸渍，并且由于分散颗粒的存在，钽NP的存在导致支架表面粗糙度的显著增加，这在以前被报道对细胞粘附、迁移和增殖具有积极影响。随着时间的推移，支架能够保持其层状结构：事实上，在生理条件下六周后，没有观察到纤维垫和明胶水凝胶之间的分层。细胞毒性评估表明，PolyGel和PolyGelTa都允许细胞存活和扩散，hMSC用于评估支架刺激其向成骨细胞谱系分化的潜力。 |
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