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微生物分离培养的三种方法
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在微生物科研领域，分离培养是关键技术。微生物在自然环境里多以混合群体形式存在，而科研常需针对特定微生物深入研究，此时分离培养技术就很重要。其原理是利用微生物的生理生化特性差异，从而把目标微生物从混合群体中分离，常用的方法有划线分离法、涂布平板法和倾注平板法。 方法一：平板划线法 （一）原理剖析 平板划线法是一种经典的微生物分离技术，其原理很简单。它是用接种环在固体培养基表面划线。把含有多种微生物的菌液用接种环蘸取后，在平板上划线，菌液会在培养基表面铺展。每次划线后，接种环上的微生物细胞数量因分散而减少，相当于稀释了一次。划线次数越多，微生物细胞越被稀释，最后分散成单个细胞。在合适的条件下，单个细胞会生长、繁殖，形成独立的单菌落。每个单菌落都是由一个单细胞繁殖而来的，理论上遗传物质相同，是纯种微生物。这样，科研人员就能从混合微生物群体中分离出目标微生物的纯培养物。 （二）操作步骤详解 取菌种：从存菌种的容器里把目标菌种拿出来。要是菌种是冷冻保存的，得先在合适的地方让它慢慢恢复活性，这样才能方便后面的操作。比如说，从低温冰箱里拿出用甘油管保存的菌种后，要把它放在 37℃的水浴锅里快速解冻。 接种针灭菌冷却：一般用镍铬合金丝做的接种环来当接种针。拿这个接种环在酒精灯外焰上烧，一直烧到金属丝发红，这样能确保把可能存在的杂菌都杀死。灭完菌后，把接种环放一边，让它自己降降温，别烫死了待会儿要接的微生物。 蘸取菌种：先用 75% 的酒精棉球擦擦手，等酒精完全挥发后，在酒精灯火焰无菌区，用已经冷却的接种环蘸点菌种。操作的时候得注意，别让接种环碰到其他可能有污染的东西，得保证蘸的菌种是纯的。 划线：拿一个已经做好的固体平板培养基。在烧接种环的时候，把平板靠近酒精灯火焰稍微消消毒，这样能少沾点平板表面的杂菌。打开平板后，先把接种环上的菌种在平板一侧连续划 3 - 4 次线，先弄出一个初始的菌带。接着一边转动平板一边用酒精灯烧接种环，再次灭菌后等它冷却，然后从起始菌带末端开始，穿过之前划的线继续划。划几次得看菌液浓度和菌种类型。要是菌液浓度高，可能得多划几次，好让菌充分稀释；对于长得快、易分散的菌种，划线次数也可以变一变。划的时候，接种环要跟平板表面保持约 30° - 40° 角，力度均匀，别把培养基划破。 标记：在平板底部边缘，用记号笔清楚地写上菌种名称、接种日期，还有其他相关信息，比如实验编号、操作人这些，这样后面能方便识别和管理平板。 培养：划好线的平板倒着放进恒温培养箱里，按目标微生物适合的生长温度来培养。把平板倒着放，是为了防止培养时产生的冷凝水滴到培养基表面，影响菌落生长和形态，也能少点杂菌污染的可能。 保存：培养好了，要是暂时不用平板上的菌种，就把它放进 4℃的冰箱里存着。保存的时候要注意把平板密封好，防止水分蒸发和杂菌污染。 （三）操作技巧与注意事项 接种环要烧一烧：每次划线前后都要用酒精灯把接种环烧红，这样才能把上面残留的微生物都灭掉。烧完后，得等接种环变凉了再接着操作，不然高温会把菌种烫死，实验就白费了。 操作得无菌：平板划线整个过程要讲究无菌，最好在超净工作台里弄。要是没有超净工作台，就在酒精灯火焰旁边操作，这样能少沾点杂菌。操作的时候，手别乱碰平板里面和接种环前端接触菌种、培养基的地方。 力度要适中：划线的时候别太用力，不然会把培养基划破。要是培养基破了，菌落长不好，分布也不均匀，而且不同区域的微生物会混在一起，就达不到分离的效果了。 平板得挑挑处理处理：选平板培养基时，表面要干燥、硬度合适。要是平板上有水珠，微生物分布就不均匀，不利于单菌落形成。刚倒好的平板如果有冷凝水，可以倒置在 37℃培养箱里放一会儿，让水分蒸发。 标记要清楚：标记信息一定要写清楚、准确，不然容易混。要是标记模糊，后续实验里就分不清菌种和相关情况，会影响实验进行和结果分析。 方法二：涂布平板法 （一）技术原理 涂布平板法主要是根据微生物在合适环境里能生长的特点来的。先要对要分离的微生物样本做梯度稀释，这么做就是想让样本里的菌体尽量分开，变成一个个单独的细胞。稀释的次数越多，样本里的微生物细胞就越来越稀。等稀释到一定程度，原本聚在一起的微生物细胞就被分开了。接着把不同稀释程度的菌液均匀地涂在固体培养基上，这样每个单细胞在培养基上都有机会独自生长、繁殖。在合适的温度、湿度等条件下养一段时间，这些单细胞就会不断分裂繁殖，最后形成一个个能用肉眼看到的单菌落。因为每个单菌落都是由一个单细胞繁殖出来的，所以从理论上讲，每个菌落都代表了一个纯的微生物菌株，这样就能把微生物给分离出来了。而且还能通过数平板上的菌落数量，再结合稀释的倍数和涂布时用的菌液体积，算出样本里微生物的数量，所以涂布平板法既可以用来分离微生物，还能做定量分析，是比较实用的一种方法。 （二）梯度稀释与涂布操作流程 称量样品和初步稀释：称 10g 待测样品，比如土壤样品，放到有 90ml 无菌水和小玻璃珠的 250ml 三角瓶中。小玻璃珠能在振荡时让微生物细胞分散得更好。把三角瓶放摇床上摇 20 分钟，让微生物细胞充分分散在无菌水里，这就得到了 10⁻¹ 稀释液。摇完后，静置 20 - 30 秒，让大的颗粒沉下来。 继续稀释：用 1ml 无菌吸管取 1ml 10⁻¹ 稀释液，放入有 9ml 无菌水的试管中，用吸管反复吹吸 3 次，混匀后得到 10⁻² 稀释液。换支无菌吸管，取 1ml 10⁻² 稀释液，放入有 9ml 无菌水的新试管，同样吹吸 3 次，得到 10⁻³ 稀释液。依此类推，得到不同稀释度的菌液。每次换稀释度都要换新吸管，防交叉污染。 标记平板：准备些无菌平板，在底部用记号笔写上对应稀释度，比如 10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵ 等，也可以写样品名、实验日期等，方便后续识别和管理。 涂布菌液：用无菌吸管取 0.1ml 不同稀释度的菌液，分别滴到对应平板培养基上。用无玻璃菌刮刀（涂布棒）涂匀。先在酒精灯上烧玻璃刮刀灭菌，冷却后再涂布。从低浓度开始，涂完一个平板，再烧刮刀灭菌。涂的时候，刮刀和平板表面呈 30° - 40° 角，轻轻匀速涂开，别用力过猛划破培养基。 培养：涂好菌液的平板倒着放恒温培养箱里，按目标微生物的生长特性设合适温度和时间。比如，多数细菌在 37℃培养 24 - 48 小时，真菌在 25℃左右培养 3 - 5 天。倒置平板能防止冷凝水滴落，影响菌落生长和形态，还能减少杂菌污染。 计数和保存：培养结束后，取平板，选菌落数在 30 - 300 个的平板计数。统计菌落数，记录每个平板的数据。多个合格平板就算平均值。按公式 “每克样品菌株数 = （平板菌落数 ÷ 涂布稀释液体积）× 稀释倍数” 算微生物数量。计数完，若要保存平板菌种，密封后放 4℃冰箱保存。 （三）计数原则与应用 计数原则：涂布平板法里，平板上有 30 - 300 个菌落时，计数结果比较准。菌落太少，样本量小误差大；太多，菌落易重叠，都不好算。如果只有一个稀释度的平均菌落数在 30 - 300 之间，就用这个数除以涂布体积（一般是 0.1ml），再乘以稀释倍数，就是样品的细菌总数。比如，平板上有 150 个菌落，用的是 10⁻⁴ 稀释度的菌液，涂布体积 0.1ml，那细菌总数就是（150÷0.1）×10⁴=1.5×10⁷ 个/g（假设样品 1g）。如果有两个稀释度的平均菌落数都合适，就看它们菌落总数的比值。比值小于 2，取平均值；大于 2，取较小的数。比如，10⁻⁴ 稀释度平板上 120 个菌落，10⁻⁵ 的上 100 个，比值 1.2 小于 2，那细菌总数就是 [（120÷0.1）×10⁴ +（100÷0.1）×10⁵]÷2=6.1×10⁷ 个/g 。 应用场景：涂布平板法在微生物领域用处多。在食品微生物检测上，能测食品中微生物数量，看卫生质量和安不安全。像测牛奶细菌总数，就能知道污染情况，判断是否达标。在环境微生物研究里，能分析土壤、水体等环境样品中的微生物群落结构和数量变化。分离计数不同环境里的微生物，能研究环境因素对它们的影响，给环境监测和生态保护做数据支持。在工业微生物发酵时，能监测发酵液中微生物生长，优化条件，提高效率和质量。比如酿酒，测发酵液中酵母菌数量，保障发酵正常。 方法三：倾注平板法 （一）工作原理 倾注平板法的原理其实就是利用微生物能生长的特点，再加上稀释涂布的基本思路。先对微生物悬液进行逐步稀释，稀释的目的就是把微生物细胞分开来，让它们不至于太挤。稀释好之后，取少量稀释后的悬液，跟已经化开又冷却到45 -50℃的无菌营养琼脂培养基混在一起，这个温度刚刚好，培养基还是液态，能和菌液充分混匀，又不会烫死微生物。接着把混合液赶紧倒进无菌培养皿里，等培养基凝固了，微生物细胞就被固定在培养基里或者表面上了。在合适的温度、湿度条件下，微生物细胞就开始生长、繁殖，分裂了好多次之后，就能长出肉眼能看到的菌落。一个菌落就是一个细胞繁殖出来的，理论上每个菌落都是纯种微生物。要是挑出单个菌落，再做成新的微生物悬液，重复之前的那些步骤，比如稀释、混合、倒平板，重复几次，就可以把杂菌去掉，得到更纯的培养物了。 （二）操作流程与要点 配培养基：按目标微生物的要求选合适的培养基配方。比如培养大肠杆菌，用 LB 培养基就行。把配好的培养基装进三角瓶，塞紧棉塞，包好后放高压锅里灭菌。在 121℃下灭 15 - 20 分钟，把培养基里的微生物和芽孢都杀死。灭完菌的培养基放 45 - 50℃的水浴锅预热，保持液态，方便和菌液混合。 标记培养皿：在超净工作台这种无菌地方，取无菌培养皿，用记号笔在底部写上培养基名字、菌液稀释度、接种日期、样品编号等信息，方便后面区分和管理。 接种菌液：用无菌移液枪或吸管，吸 1ml 经过梯度稀释的微生物悬液，放到空培养皿中央。注意移液器具前端别碰培养皿边缘等可能被污染的地方，保证菌液纯净。 倒培养基：从水浴锅取出预热好的培养基，右手握三角瓶瓶颈，在酒精灯火焰上快速烧一下瓶口灭菌，防止杂菌污染。然后快速把培养基倒进有菌液的培养皿中央，倒 15 - 20ml，让培养基能盖住整个菌液，在培养皿里形成合适厚度。 混合培养基：倒完培养基后，马上双手握住培养皿，轻轻顺时针和逆时针交替转，让菌液和培养基混匀。转的时候速度和力度要合适，别产生太多气泡，也别用力过猛让培养基溢出，同时要快点操作，防止培养基凝固。 等培养基凝固：把混合好的培养皿放平，静置等培养基凝固。过程中别动培养皿，以免影响培养基平整度和菌落分布。一般室温下 15 - 30 分钟就能凝固。 培养：凝固后，把培养皿倒着放恒温培养箱里，按微生物生长条件培养。多数细菌在 37℃培养 24 - 48 小时，真菌在 25℃左右培养 3 - 5 天。倒置培养皿能防止冷凝水滴落，影响菌落生长和形态，也能少杂菌污染。 计数和挑单菌落：培养结束后，取培养皿，选菌落数在 30 - 300 个的平板计数，记录菌落数。要纯培养物的话，用无菌接种环挑平板上形态典型、孤立的单菌落，接种到新的液体或斜面培养基培养。挑菌落时，让接种环只接触目标菌落，别碰周围杂菌。 重复操作：把挑取的单菌落制成新的微生物悬液，再做梯度稀释、混合培养基、倾注培养等操作，重复 2 - 3 次，提高微生物纯度，确保得到纯种培养物。 三种方法的比较与选择 这三种微生物分离培养法各有特点，科研人员会根据实验需求和条件选择合适的方法。 操作难度上，平板划线法最简单，步骤少，要求低，易上手；涂布平板法复杂些，得梯度稀释、无菌操作，对技巧和耐心要求高；倾注平板法最繁琐，需梯度稀释、控温，操作稍有不慎就影响结果。 适用场景方面，平板划线法适合分离要求高的实验，如从混菌中分离纯种，用于鉴定等；涂布平板法常用于计数和筛选；倾注平板法适用于初步估计数量和分离对热不敏感微生物。 分离效果上，平板划线法操作得当分离效果好；涂布平板法通常较好且易控制；倾注平板法受限多，但多次操作也能纯化。 计数能力方面，平板划线法一般不能计数，涂布和平注法都能计数，但涂布法更准确。 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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