| 查看: 536 | 回复: 1 | |||
我太秀了铜虫 (小有名气)
|
[交流]
一文了解基因敲除细胞系：概念、构建流程、应用场景、FAQ 已有1人参与
|
|
在生命科学研究领域，基因功能解析是探索疾病机制、开发靶向药物的核心环节。而基因敲除细胞（Knockout Cell，简称 KO 细胞）作为研究基因功能的 “利器”，已广泛应用于基础科研、药物研发等多个领域。小源也曾在KO细胞构建上吃过不少亏，所以根据多年的基因编辑经验总结了这篇文章，希望能够帮助大家在KO细胞研究的路上少点坎坷。 什么是基因敲除细胞（KO 细胞）？ 基因敲除细胞（KO细胞） 是指在特定细胞中人为删除或失活某个基因 ，从而使该细胞不再表达该基因编码的蛋白质的细胞系。常用的方法如CRISPR-Cas9技术：利用Cas9核酸酶在目标基因处产生双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）导致框移突变，使基因失活。 CRISPR-U™ 是源井生物自主研发的高效细胞基因编辑平台，基于 CRISPR/Cas9 技术，结合独特的 gRNA 设计算法、丰富的细胞系编辑参数数据库、精确的 Pool 编辑效率检测方法、单克隆形成率提升策略，以及适用于微量细胞的高通量基因型鉴定体系。在基因敲除细胞系构建方面，源井生物自主研发的 CRISPR-U™ 技术相较于传统方法,可将基因编辑效率提升 10–20 倍。 为什么要做KO细胞？ 与普通细胞相比，KO 细胞的核心价值在于：通过 “去除” 某个基因，观察细胞在生理、病理状态下的表型变化（如增殖、凋亡、代谢异常等），进而反向推导该基因的生理功能，或明确其在疾病发生发展中的作用。 简单来说，KO 细胞就像 “基因功能的放大镜”—— 当某个基因被 “关闭” 后，细胞出现的异常变化，往往就是这个基因原本负责调控的生理过程，为科研人员提供直接的研究线索。 KO 细胞如何构建？ 目前主流的KO 细胞构建策略以 CRISPR/Cas9 技术为主，其原理是借助 gRNA 对靶序列的特异性识别，引导 Cas9 核酸内切酶在靶序列的 PAM 基序上游完成精准切割，造成靶位点 DNA 双链断裂；随后细胞启动自身的 DNA 损伤修复应答机制，将断裂的 DNA 上下游末端直接连接，最终实现目标基因的功能敲除。 （一）通用构建流程：四步完成 KO 细胞制备 1.目标基因与靶点设计 首先明确研究目标（如敲除某致癌基因、代谢相关基因），通过基因数据库（如 NCBI、Ensembl）获取目标基因的全长序列，选择外显子区域（尤其是编码起始区或关键功能域） 作为编辑靶点 —— 此处敲除可最大程度确保基因失活，避免产生截短的功能性蛋白。 【小Tips】：可以选择的情况下，敲除区域需要覆盖所有转录本，如果无法选择，优先考虑主要转录本 (有CCDS编号的，NM开头的) 2.基因编辑工具导入 根据选择的技术（如 CRISPR/Cas9），构建含靶点序列的编辑载体（如 sgRNA 载体 + Cas9 蛋白 / 载体），通过转染（脂质体转染、电穿孔）或病毒感染（慢病毒、腺病毒）的方式，将编辑工具导入宿主细胞（常见如 HEK293T、Hela、RAW264.7 等细胞系）。 【小Tips】：推荐使用源井红棉·CRISPR基因编辑系统设计sgRNA，系统集成“基因风险评估”、“表达量评估”、“拷贝数评估”等辅助小工具，可实现实验方案的一键化风险与难度评估，有效提升基因编辑设计效率与成功率。 3.阳性细胞筛选 编辑工具导入后，仅有部分细胞会发生目标基因敲除，需通过筛选标记（如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因）筛选阳性细胞： 短期筛选：使用对应抗生素（如嘌呤霉素、潮霉素）培养，淘汰未导入载体的细胞； 单克隆分选：通过有限稀释法或流式细胞分选，获得单个阳性细胞克隆，确保后续细胞的基因一致性。 4.敲除效果验证 这是关键一步，根据需求选择多层级验证确认基因已成功敲除： 基因型验证：采用 PCR 扩增目标基因区域，结合测序或电泳，确认基因片段是否缺失； 蛋白水平验证：通过 Western Blot 检测目标蛋白的表达量，若蛋白完全不表达，说明敲除成功； 表型验证：观察细胞是否出现预期表型（如敲除凋亡抑制基因后，细胞凋亡率升高），进一步确认敲除有效性。 （二）常见的几种KO细胞构建方法 1. 质粒法 将携带有荧光、抗性标签的普通单质粒载体，通过电转或lipo的方式转到细胞中，载体上转录表达的sgRNA和Cas9蛋白组成有活性的复合体，对细胞基因组DNA进行打靶编辑，通过单克隆筛选获得目标敲除细胞株。 注：载体瞬时转染，理论上不整合基因组，但也有一定概率被整合，可通过观察最终单克隆是否携带荧光标签来判断。 2.RNP法 体外合成的sgRNA序列，与Cas9蛋白孵育形成复合体后，通过电转的方式转到细胞中，有活性的复合体直接对细胞基因组DNA进行打靶编辑，通过单克隆筛选获得目标敲除细胞株。 3. 病毒法 将gRNA和Cas9蛋白通过慢病毒载体，利用单质粒或双质粒系统包装慢病毒，转染细胞，使gRNA和Cas9序列随机整合到细胞基因组DNA中，持续表达，通过单克隆筛选获得目标敲除细胞株。 KO 细胞的应用场景与经典案例 KO 细胞的应用贯穿生命科学研究的多个领域，其核心价值在于 “明确基因功能” 和 “模拟疾病模型”，以下是KO细胞的核心应用场景及经典案例： （一）基础科研 在基础研究中，KO 细胞是 “基因功能验证的金标准”。通过对比 KO 细胞与正常细胞的差异，可直接明确目标基因在细胞代谢、信号通路、分化发育等过程中的作用。 案例：TP53 是著名的 “抑癌基因”，科研人员通过 CRISPR/Cas9 技术构建TP53-KO 的HCT116 细胞系，与正常 HCT116细胞对比发现：p53通过直接占据BCL-2的BH3结合口袋与之形成复合物，并通过释放位于口袋的促凋亡BCL-2家族蛋白来拮抗BCL-2活性，从而促进细胞凋亡[1]。 （二）药物研发 在药物研发中，KO 细胞可用于 “靶点验证” 和 “药物筛选”，避免因靶点错误导致的研发失败。 案例：ZNF蛋白被证实为调节哺乳动物细胞基因组完整性的关键因子，为探究ZFP可作为基于同源重组(HR)的DNA修复效应器的可能性，拉瓦尔大学Jean-Yves Masson 团队采用源井构建的U2OS敲除ZNF432细胞系进行了一系列实验，发现ZNF432在癌细胞中缺失会加速DNA修复，导致PARPi作用减弱，使卵巢癌细胞产生耐药性，证实ZNF432是一种新的HR抑制因子，成功拓宽了研究PARPi疗效的新途径[2]。 （三）疾病模型 部分人类疾病由单基因缺失或突变引起（如囊性纤维化、镰状细胞贫血），KO 细胞可作为 “体外疾病模型”，用于研究疾病机制或测试治疗方案。 案例：研究对494例来自中国不同地区的肝细胞癌患者肿瘤组织进行了高深度的全基因组测序（平均120x），深入分析了编码区和非编码区的驱动基因、突变印记、拷贝数变异、聚集式变异事件（clustered alteration：chromothripsis, chromoplexy和kataegis）、染色体外环状DNA（extrachromosomal circular DNA, ecDNA）以及突变演进规律等特征。还选取了3个新鉴定的潜在驱动事件进行详细功能验证，综合CRISPR定点突变及多个细胞系敲降/敲除实验，发现上述基因的突变足以导致基因表达水平的显著变化（其中PPP1R12B, KCNJ12, FGA基因敲除细胞和携带突变位点的过表达慢病毒均由源井生物构建），并参与调控肝细胞癌的多种恶性表型，这些结果证实基于数据分析发现的新驱动事件的有效性[3]。 KO 细胞常见 FAQ Q1：CRISPR/Cas9 构建 KO 细胞时，如何降低脱靶风险？ 1.gRNA设计优化：使用在线工具设计靶点，选择 “脱靶评分高” 的序列（通常要求靶点在基因组中唯一，或仅与其他序列有 2 个以上碱基差异）； 2.使用 Cas9切口酶：将 Cas9 改造为仅切割单链的切口酶，需同时导入 2 个 sgRNA 靶向相邻区域，才能形成双链断裂，大幅提高特异性； 3.脱靶检测验证：通过全基因组测序或靶向测序，检测潜在脱靶位点（如与靶点序列相似的区域），确认无脱靶后再使用细胞。 Q2：sgRNA 设计有哪些注意事项？ 1.确保gRNA的特异性，避免发生较多的脱靶编辑; 2..gRNA序列尽量覆盖较多的转录本; 3.避免RNA序列靠近编码蛋白的N端或C端，发生外显子跳跃等机制，产生截短的蛋白异构体; 4.避免重复序列，减少非特异性剪切的可能性; 5.确保序列不含二级结构，提高其有效性; 6.使用T7/U6启动子驱动sgRNA表达时，5’端碱基最好为G，或人为添加一个G提高转录效率。 7.使用源井红棉·CRISPR基因编辑系统设计sgRNA，只需输入基因和细胞名称，一键生成3套gRNA方案。 Q3：构建 KO 细胞后，发现目标蛋白仍有少量表达，是什么原因？如何解决？ 这种情况称为 “不完全敲除”，常见原因及解决方法如下： 原因 1：基因敲除不彻底（如仅敲除了等位基因中的一个，即杂合子敲除）：通过 PCR 测序确认基因型，筛选纯合子敲除的单克隆细胞； 原因 2：靶点选择不当（如敲除的外显子区域不影响蛋白核心功能，导致产生截短的功能性蛋白）：重新设计靶点，选择编码起始区或关键功能域的外显子，重新构建 KO 细胞； 原因 3：细胞污染或混克隆：通过单克隆分选重新获得纯克隆，并用 Western Blot 再次验证蛋白表达。 原因4：抗体特异性低，如果是出现很多杂带，或者条带单一但是与理论大小差距较大的，也可能是非特异性条带。 欢迎大家在评论区留下你在构建KO细胞时遇到的困难,我们一起讨论~ |
回复此楼» 猜你喜欢
一志愿武理材料工程348求调剂
已经有6人回复
-
08工科 320总分 求调剂
已经有11人回复
-
一志愿华中农业071010，总分320求调剂
已经有6人回复
-
323求调剂
已经有5人回复
-
284求调剂
已经有5人回复
-
317求调剂
已经有16人回复
-
287求调剂
已经有9人回复
-
求调剂
已经有6人回复
-
308求调剂
已经有3人回复
-
环境学硕288求调剂
已经有6人回复
滴滴Grace合肽库
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1729.4
- 散金: 226
- 沙发: 2
- 帖子: 839
- 在线: 74.7小时
- 虫号: 23321770
- 注册: 2020-08-05
- 性别: MM
- 专业: 外国语言
2楼2025-12-25 10:04:13
40