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污染了，如何鉴定是什么坏东西干的？
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养细胞遭遇污染是一种非常常见的情况，如果一觉睡醒发现细胞周围有许多黑色点点或杆状不明物体在旋转跳跃，那也差不多可以轻轻地闭上眼把整个瓶子都扔了。 1 总体思路 先说路线：分离 → 纯化 → 鉴定 如果我们能确定污染物是一种细菌，即便肉眼可见有很多黑点，细菌的生物量很可能还是不比原本培养的细胞多。 那么，如何有效地将数量上可能占劣势的细菌与大量动物细胞分离开，并进行纯化与鉴定，就是核心难点。 在细胞培养污染这个场景中，制备送检样本比鉴定本身还要重要。 有一些比较老的教科书认为应该直接从培养物中取样，用无菌生理盐水进行稀释，通过平板划线或涂布稀释培养获取单个菌落，然后取单个菌落进行染色、生化、PCR等检测。 但是，从培养物中分离细菌这一步的要点应该是如何把培养的细胞和细菌分开，直接稀释做不到这一点，所以我们在中间增加了一些步骤。 另外，现在各种商品化试剂盒非常丰富，检验科的同学应该见过，类似下面这种试纸就可以快速鉴定是否属于某些常见菌，PCR试剂盒种类也很多，所以鉴定这一块也比较省事了。 a 分离与富集：将细菌从培养物中分离出来 这是最关键的一步，目标是最大程度地减少真核细胞的干扰，富集细菌。把有限的试剂用到细菌上。 细菌虽然也是细胞，但哺乳动物细胞（直径~10-20 μm）比大多数细菌（直径~0.5-5 μm）大得多，所以我们看到的往往是会动的黑点。 利用这一点，我们可以用一些比较便宜的方法进行初步分离与富集，避免在鉴定这一步花更多经费。 这里有两个物理方法：差速离心法和过滤法。 差速离心法 操作： 取少量被污染的培养物（1-2 mL）。 首先低速离心：首先低速离心以分离细胞与细菌。如以200 × g离心力离心5-10 min使培养的细胞形成松散的沉淀，而细菌大多依然悬浮在上清中。小心吸取含细菌的上清液，转移至新的无菌离心管中。 其次高速离心：此时将上清以约10,000-15,000 × g的离心力离心 2-5 min，沉淀细菌。随后弃上清。 用少量无菌生理盐水或PBS重悬细菌沉淀。你得到的就是一个细菌已经被显著富集、而且细胞碎片干扰大大降低的样品。 优势：多快好省，能有效去除大部分真核细胞。 过滤法 根据细菌和细胞的大小差异，选择孔径为0.45 μm的滤膜过滤。 细菌（尤其是杆状这种一条的）可以通过滤膜，而哺乳动物细胞则被截留。只需将污染培养物通过无菌过滤器，收集滤液即可。滤液中含有细菌，可用于后续涂布。 但需注意有些细菌长得比较大，又或是成簇的细菌、粘附在细胞上的细菌，这些块头比较大的个体可能被截留，造成漏检。 如果原细胞培养液中含抗生素，细菌生长可能被抑制。此时最好还是离心一次，以去除含抗生素的上清，用无菌PBS洗涤沉淀。 b 纯化：获取单菌落 选择性培养 在涂布平板前，根据获得的细菌样本量，可能还是要先简单富集培养一下，以获取更多的可用菌，或进一步分离。 可以考虑将样品接种到细菌专用液体培养基（如实验室里那瓶引人注目的“LB肉汤”）中，在适宜温度（可以直接设置37°C）下震荡培养几小时。 原本培养的细胞一般不会很喜欢这种没有血清又不是贴身设计的培养基，可以达到一定富集、纯化活菌的效果。 获取单菌落 然后进入不必多言的教科书传统方法环节： 平板划线法 涂布平板法 然后将平板倒置于普通培养箱中培养1-3天。有长势喜人的菌落后，挑取形态单一、特征明显的单个菌落进行革兰氏染色镜检，确认是否为纯培养物。 c 鉴定：鉴定细菌物种 作为第一步的革兰氏染色 除了记录细菌形态（球菌/杆菌/螺旋菌等基础分类）外，可以考虑首先进行革兰氏染色，以将后续鉴定限制在一个范围内，节省精力资源。 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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