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具有内在免疫调节特性的智能碳化钽MXene量子点治疗异体移植血管病变的制备
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介绍 低维碳基纳米材料无疑是当今的“神奇材料”。自2004年发现石墨烯以来，人们已经对石墨烯及其衍生物进行了研究广泛应用于电子电路、储能、光处理、化学处理和生物医学应用。最近，0D石墨烯和MXene量子点（MQDs）被发现通过与多种免疫活性细胞的相互作用而具有广泛的免疫调节活性。特别是，与传统石墨烯材料相比，较新的mqd有潜力提供更好的分散性、可调性和生物相容性，同时保持免疫调节生物活性。 然而，钛基材料的长期生物惰性已经受到了质疑。事实上，一些关于Ti3C2Tx MXene在中到高浓度下的细胞毒性的报告引起了对这些材料最终临床可转译性的显著关注。因此，该技术的未来应用取决于解决这一基本限制。 为了应对这一挑战，已经开发了其他MXene组合物，例如碳化铌(Nb2C ),其具有降低的细胞毒性潜力。然而，铌并未普遍用于生物医学应用，其长期安全性仍知之甚少。另一方面，钽基生物材料得到了充分的研究，并已明显显示出比钛基生物材料具有更好的耐腐蚀性、生物相容性和生物活性。特别是，氧化钽已被证明比其钛基对应物更加稳定和惰性，这有助于钽基材料的优异生物安全性。体外和体内实验证实了这些发现，表明高剂量碳化钽(Ta4C3Tx) MXene纳米片(MNSs)的安全性。然而，还没有报道高度合意的Ta4C3Txmqd的成功合成。mqd由于其改善的水稳定性和亚细胞水平的相互作用而独特地适用于生物医学和免疫工程应用。因此，迫切需要开发Ta4C3Tx mqd以跟上这一快速发展的领域。 Ta4C3Tx mqd通过定制的蚀刻、剥离和水热法被合理地设计用于生物医学应用。合成的mqd表现出高浓度的MXene表面官能团以及表面钽氧化物(TaO2和Ta2O5)，这有助于其与人类细胞的优异生物相容性。特别是，高浓度的Ta4C3Tx mqd不会在培养的人内皮细胞(ECs)中诱导氧化应激和细胞毒性。此外，这些mqd被自发地内化到内皮细胞中，并通过调节T细胞的活化而机械地降低了这些细胞的免疫原性。最后，当应用于器官移植排斥的体内模型时，静脉内给予Ta4C3Tx mqd减少了移植组织内的免疫细胞浸润和结构变性。总之，这项研究突出了定制的Ta4C3Tx mqd在免疫工程和其他生物医学应用中的未来潜力。 结果与讨论 Ta4C3Tx量子点的基本原理、设计和合成 生物医学相关纳米材料的工程要求严格控制其化学组成、结构和性质。本研究中对钽基MXene的慎重选择源于对生物相容性和生物活性的考虑。尽管有充分的证据表明 Ti3C2Tx MXene纳米片和量子点的生物医学功效，增加了对其潜在细胞毒性的关注，尽管在较高剂量下，也不能忽视。在水热过程中或在水分散时，在Ti3C2Tx mqd的表面上可以形成大量暴露的钛氧化物(TiO2和Ti2O3)。 在设计用于生物医学应用的材料时，氧化钛的存在尤其令人担忧，因为它可以催化活性氧物质(ROS)的产生，并对附近的细胞和组织产生氧化应激。这种活性氧激增还会诱导残留组织巨噬细胞释放促炎细胞因子，从而阻碍免疫调节物质的功能。 因此，在目前的研究中，ta4c3tx mqd是根据生物医学应用专门设计的，并使用简单的方法进行合成，以适应这些设计要求。使用盐酸/氟化钠(HCl/NaF)作为蚀刻剂，对ta4c3MAX相进行化学蚀刻并剥离以形成手风琴状的ta4c3tx MNSs。随后将所得MXene产物分散在纯蒸馏水中，并通过水浴超声进一步处理，以获得多层、寡层和单层ta4c3tx MXene纳米晶体。最后，将获得的含水胶体悬浮液在180℃下水热处理12小时，以获得0D ta4c3tx mqd。生产ta4c3txmqd的逐步示意图如图1A所示。 ta4c3tx MXene纳米片通过超声处理和随后的均化处理来提高其比表面积和水胶体分散性。特别是，机械振动和/或超声处理增加了阳离子插层的程度，并进一步增加了层间间距。结果，获得的胶体溶液包含分散良好且静电稳定的MXene纳米片。此外，由该方法生产的MXene薄片的胶体悬浮液不太可能结块或聚集，从而增加了其进一步功能化的可及性。因此，该方案为生物活性和临床可翻译的ta4c3tx mqd的工业开发提供了可能性。 图1.合成示意图模型、化学计量和材料表征。a)使用简易方案将Ta4AlC3最大相体积转化为0D ta4c3tx mqd的分步示意图。简而言之，使用HCl/NaF蚀刻剂蚀刻Ta4AlC3 MAX相粉末以移除Al层并合成ta4c3tx MXene纳米片。这种湿法蚀刻在合成过程中连续进行48小时。同时，在60℃下加热增强了Ta4AlC3的剥离和功能化，以形成手风琴状的2D MXene。剥离的ta4c3tx纳米片通过超声和机械振动进一步处理，以获得多层、寡层和单层薄片，随后使用水热法处理，以形成具有集中的官能团以及稳定的表面钽氧化物的ta4c3tx mqd。b)合成ta4c3tx mqd的拟议反应化学，包括用氧化钽(TaO2和Ta2O5)进行表面改性。c–H)ta4c3tx MNSs和mqd的形态和微结构特征。c，d)多层Ta4C3Tx纳米片的高分辨率TEM (HRTEM)图像显示了轮廓分明的剥离晶体，其晶格d间距为»0.260 nm。e)此外，纳米片的相应SAED图案描绘了MXene材料典型的均匀六边形结晶图案。f)ta4c3tx mqd的HRTEM图像显示了在180℃水热处理后具有高表面官能化的颗粒的适当合成。g)如图所示，单个ta4c3tx颗粒的平均直径为»3.5 nm，这对于靶向亚细胞应用是理想的。h)量子点的晶格间距为»0.338纳米。总的来说，这些数据支持了新型ta4c3tx mqd的成功设计和生产。 合成Ta4C3Tx量子点的反应化学 图1B给出了在上述制造工艺中合成ta 4c3tx mqd的化学反应。使用两步法实现Ta4AlC3 MAX相的剥离。首先，通过在G0℃下用12mHCl处理来氯化MAX相粉末，以通过形成氯化铝(AlCl3)来显著去除表面Al层。此外，蚀刻溶液中NaF的存在通过形成六氟铝酸钠(Na3AlFG)完成了剥离过程，进一步去除了任何残留的Al痕迹。这导致了吮吸 多层Ta4C3Tx MXene纳米片的成功生产(图1B，方程(1))。此外，搅拌过程中NaF的存在导致了MXene层具有丰富的-OH基团的进一步表面官能化。此外，提出的反应化学也支持具有富F表面末端的最终产物的有效氟化。总之，这些反应机制使得Ta4AlC3 MAX相粉末的容易剥离和2D Ta4C3Tx MXene纳米片的有效合成成为可能(图1B，方程(1)-(3))。 在胶态分散体的功能化过程中发生的化学反应是在水介质中Ta4C3Tx MNSs部分氧化后发生的(图1B，等式(4))。水热过程导致在ta 4c 3 tx mqd表面形成氧化钽(TaO2和Ta2O5)层，可能是通过二次晶核形成机制(图1B，方程式(5)和(G))。 Ta4C3Tx多量子点的微结构表征 使用我们的创新合成工艺成功合成了ta 4c3txmqd，使用透射电子显微镜(TEM)、快速傅立叶变换(FFT)分析、选区衍射(SAED)分析和能量色散X射线光谱(EDS)证实了这一点。Ta4AlC3 MAX相的扫描电子显微镜(SEM)图像及其相应的EDS分析显示，组合物中Al的原子百分比为19.77%。用HCl/NaF处理后的Ta4C3Tx纳米片的TEM图像显示了MXene层的堆叠基面(图1C)。 为了进一步表征MAX相向ta4c3tx mqd的结构转变，进行了X射线衍射(XRD)分析。我们的数据表明，在Ta4C3Tx MQDs样品中，MXene的主要特征峰(002)清楚地出现在7° 2θ处(图2A，b)。同时，剥离和水热处理后，Ta4AlC3峰明显下移。特别是，1G° 2θ处的一个主要最大相位峰完全从ta4c3tx mqd的XRD谱图中移除。此外，在ta4c3tx mqd的XRD图中发现了10°和30° 2θ之间的微小无定形曲线(图2B，C)。此外，在50° 2θ的MAX相的XRD谱中碳化钽(Ta2C)的污染峰在ta4c3txmqd的XRD谱中完全消失，反映了合成的效率和最终产物的纯度。 铝蚀刻的Ta4C3Tx的XRD图显示了mqd的原子结构中扩大的晶格间距(图2B)。这种膨胀很大程度上归因于合成过程中的表面官能化。因此，这些特征证明了表面改性的ta 4c3txmqd的成功生产。 图2.合成态Ta4C3Tx量子点的结构、官能团和化学组成的表征。a–C)ta4c3txmqd的XRD相位特征在5°至80° 2θ时进行。我们的XRD数据显示了ta4c3txmqd中MXene材料在7° 2θ处的主要特征(002)峰。mqd的高分辨率XRD分析描绘了含Al峰的显著下移，这有力地证实了Ta4C3Tx MXenes的合成。主要根据碳化钽、碳化钽氧化物和氧化钽相的标准参考代码(96-210-3218、ICSD156383和v-alumina).)匹配峰MQDs的FTIR分析。我们的FTIR数据显示在mqd的表面上清楚地形成了额外的官能团。FTIR光谱在3500 cm-1显示了一个宽峰，这可能是由于量子点中晶格参数的扩展。e)这些mqd的宽扫描XPS光谱显示，在合成过程中，结合能为64-80和115-125 eV的主要Al 2p和Al 2s峰被显著地从材料成分中提取出来。我们的XPS调查还显示了定义明确的MXene特征(Ta4f、Ta4p、C1s、O1s、c12p、na2s和F1s ),与MAX相结构相比，表面功能化程度较高。此外，Ta4f、C1s和O1s的窄光谱证实了Ta4c3txmqd的成功合成。 图3.Ta4C3Tx量子点的热物理和光吸收特性。a–C)氩气和大气条件下ta4c3txmqd的TGA/DSC分析。a)在氩气下，ta4c3tx mqd的TGA分析表明，ta4c3txmqd在高达800℃的温度下退火后，对材料的表面终止或分解没有显著影响。B)此外，我们的数据显示，在350℃后没有显著的质量损失，并且在该温度范围内，焦炭残留高于90%。c)然而，在正常的大气条件下，由于»600之后的氧化过程，ta4c3txmqd的TGA曲线显示了质量百分比的稳定增加。d)ta4c3txmqd的紫外-可见光谱显示了在300 nm区域的强剂量依赖性吸收，对应于横向碳结构，以及在大约900nm处的额外宽吸收峰。e，f)在404和808nm下，测得新型ta4c3txmqd的计算分别为0.525和0.573Lg-1cm-1。g)ta 4c 3 tx mqd的ζ电势在2至12的pH范围内很大程度上是负的(大约0至-30mV)。在pH高于10时，注意到mqd的表面电荷略有增加，这可能是由于在强碱性条件下颗粒官能团的性质变化。 Ta4C3Tx量子点的热学、光学和表面性质 MXene纳米结构的表面性质由其合成条件决定。在这方面，必须应用有效的制造方法来获得具有所需表面终端和长期稳定性的MXene材料。 在当前的研究中，使用TGA评估了ta4c 3txmqd的稳定性。 我们的ta4c3txmqd的TGA曲线描绘了在150和300℃之间的轻微质量损失，并且在大约g00时其炭残余为10%(图3A)。然而，我们的热重分析数据显示，350℃后几乎没有质量损失，在此温度范围内，其残炭高达91%(图3B)。有趣的是，我们的TGA数据表明，将ta4c3txmqd退火至800℃对其表面终止没有显著影响，并且不会导致材料的显著分解位置。在高于800℃的退火温度下观察到少量质量增加(1% ),这很可能归因于杂质的氧化或材料的轻微分解。相比之下，在正常大气条件下生成的ta4c3txmqd的TGA曲线显示，从900c开始，由于氧化过程，其质量百分比持续增加(图3C)。从我们的结果中可以看出，在氩气和大气条件下，差示扫描量热法(DSC)曲线的热流数据与获得的热重分析结果非常一致(图3B，C)。总之，这些数据支持当前研究中采用的无HF方案能够成功合成高度稳定的Ta4C3Txmqd。 Ta4C3Tx量子点的生物相容性 利用与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的共培养物在体外评估合成的Ta4C3Tx MQDs的生物相容性。内皮细胞形成了血管的内层，并作为身体和静脉注射的纳米材料之间的第一接触点。这些细胞在炎症调节、coag形成和向不同组织的营养输送中也起着重要作用。因此，内皮毒性会显著限制纳米材料未来的生物医学应用。 活性氧的增加还会诱导常驻组织巨噬细胞释放促炎细胞因子，并干扰体内植入生物材料的抗炎和免疫调节特性。因此，在当前的研究中，我们首先评估了Ta4C3Tx MQDs的存在是否会导致细胞中产生任何ROS。将huvecs在有或没有不同剂量的ta4c3tx mqd(磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2至100 mg mL-1)的情况下培养24小时。使用CellROX绿色荧光染料评估细胞内ROS水平。从我们的数据中可以明显看出，在本研究使用的浓度范围内，ta4c3txmqd没有增加细胞内ROS水平(图4A，B)。 图4.ta4c3txmqd的活性氧产生和生物相容性的评估。a)使用绿色荧光探针评估HUVECs中的总细胞ROS。b)与对照相比，用浓度为2至100mgmL-1的ta4c3txmqd培养不会增加总细胞ROS。c)此外，使用绿色荧光探针评估胱天蛋白酶-3/7的激活，与对照相比，浓度为2至100mg mL-1的Ta4C3Tx MQDs没有增加凋亡激活。d)使用LDH释放试验在不同的MQD浓度(0.5至20 mg mL-1)下评估3天时的生物相容性。在MQD处理组和对照组之间没有观察到最大LDH释放的显著增加。e)使用WST-1细胞增殖试验在不同的MQD浓度(0.5至20 mg mL-1)下评估7天的生物相容性。在MQD处理组和对照组之间没有观察到细胞增殖的显著差异。 Ta4C3Tx量子点的免疫调节特性 使用活化的HUVECs和的共培养物在体外研究了ta4c3txmqd的免疫调节特性人外周血单核细胞。作为血液和组织之间的屏障，内皮细胞在器官移植排斥反应的病理生理学中起着至关重要的作用。同种异体移植(供体来源)后，内皮细胞被激活并充当受体免疫系统的抗原呈递细胞，导致免疫激活、血管损伤和随后的同种异体移植物(供体器官)排斥。特别是，促炎性1型T辅助细胞(TH1)的募集对同种异体移植排斥的发展和进展至关重要。因此，在这项研究中，我们使用活化的HUVECs、PBMNCs和TH1细胞作为器官移植排斥的模型，检测了ta4c3txmqd的免疫调节作用(图5)。 图5.ta4c3txmqd免疫调节作用的体外评价。a)体外免疫调节模型的示意图。ta4c 3txmqd与HUVECs相互作用，减少共培养淋巴细胞的炎症活化。b)ta4c3txmqd对人淋巴细胞的细胞毒性评估。当用2mg mL-1的mqd处理淋巴细胞时，没有观察到显著的细胞毒性。c)显示体外免疫调节评估时间线的示意图。用Ta4C3Tx MQDs预处理HUVECs，用IFN-γ活化，然后与人淋巴细胞共培养9天。d)用于免疫调节分析的流式细胞仪门控策略。单个淋巴细胞通过CD3+CD4+门进行门控。e)IFN-γ和IL-4的细胞内染色分别用于鉴定TH1和TH2辅助性T细胞。f)当人淋巴细胞与活化的huvecs共培养时，用2mg mL-1的ta4c3txmqd处理降低了TH1细胞的百分比。g)在共培养实验中，未观察到TH2细胞百分比的显著差异。 Ta4C3Tx在体内免疫调节 为了了解Ta4C3Tx MQDs的免疫调节机制，我们研究了Ta4C3Tx MQDs与HUVECs的直接相互作用。有趣的是，在本研究中发现Ta4C3Tx MQDs被内皮细胞快速摄取，并定位于细胞核附近（图6A）。Ta4C3Tx MQDs表面丰富的带负电荷的羟基、羧基、氯、氟和胺基官能团可能促进了这种内化。此外，Ta4C3Tx MQDs表面电荷的ph依赖性变化（图3G）可能促进了它们内化后不久的内吞体逃逸。由于Ta4C3Tx MQDs的负电荷较小，它们可以与核内体的膜相互作用，逃逸到细胞质中。这最终允许它们与核蛋白和细胞质蛋白相互作用，并参与随后的免疫调节信号传导。 为了深入了解Ta4C3Tx MQDs诱导的免疫调节信号传导机制，我们在HUVECs中进行了基于定量聚合酶链反应（qPCR）的基因表达分析（图6B，C）。如图所示（图6B，C），Ta4C3Tx MQDs没有显著改变与抗原呈递相关的基因（IRF1、TAP1、HLA-A、B2M、HLA-DRα、CIITA）、细胞粘附（PECAM-1、V-E-钙粘蛋白）、淋巴细胞募集（VCAM-1、ICAM-1、P-Seleletin）或趋化因子信号（CCL-2、CXCL9、CXCL10）的表达。 图6.ta4c3txmqd免疫调节作用的机理评估。a)光学显微镜显示，培养24小时后，ta4c3tx mqd易于内化到HUVECs中。b，C)针对涉及抗原呈递、细胞粘附、淋巴细胞募集和趋化因子信号传导的基因进行定量PCR分析。用IFN-γ激活HUVECs导致促炎信号的增加。在用20 mg mL-1的ta4c3txmqd处理的细胞和载体对照之间没有观察到显著差异。d)发现用Ta4C3TxMQDs处理改变了活化的HUVECs表面上T细胞共抑制剂PD-L1和T细胞共激活剂CD86的表达。PD-L1的内皮表达显著增加，用20mgmL-1的ta4c3txmqd治疗后，观察到CD86减少的趋势。e)ta4c3txmqd的免疫调节机制的示意图。mqd通过主动内吞作用被内化到细胞中，之后它们的表面结构促进了内体逃逸。然后它们参与免疫调节信号，改变表面辅激活因子和辅抑制因子的比例，从而导致T细胞活化减少。 最后，利用大鼠异体移植血管病变模型，探讨合成的Ta4C3Tx MQDs在体内的免疫调节作用。实体器官移植后，供体内皮损伤和激活导致受体体内同种反应性t淋巴细胞的激活。同种异体移植物最终丢失的病理机制之一是同种异体移植物血管病变的发展。这种炎症状态的独特表现是移植的心脏、肺和肾脏内的血管加速狭窄。目前建立的治疗方法基本上无效，基于ta4c3Txmxene的免疫调节可能为这一治疗挑战提供一种新的治疗方法。 在本研究中，从雄性Lewis大鼠的胸降主动脉中移植到雄性斯普拉格-dawley大鼠的腹主动脉（图7A-C）。图7D所示，移植动物的腹主动脉组织学切片与假手术动物相比，有明显的炎症变化。此外，在对照组和MQD处理的动物之间，内皮细胞增殖和外膜免疫细胞浸润方面均存在显著差异（图7E，箭头）。 为了量化血管损伤的程度，我们对阿尔法平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行了免疫组化，这是血管完整性的标志。同种异体移植物血管病变的早期迹象是免疫介导的表达内侧平滑肌细胞的α-SMA的丢失。在这里，我们注意到，在对照组动物移植的主动脉节段内，内侧α-SMA的数量显著减少（图8A）。 图7。在大鼠主动脉移植物血管病变模型中体内评价ta4c3txmqd的免疫调节作用。a)模型的示意图。将雄性Lewis大鼠的胸降主动脉移植到雄性Sprague-Dawley大鼠的腹部。动物接受1毫克kg-1体重的Ta4C3Tx MQDs的尾静脉注射，并保持7天。b)显示移植主动脉段的照片。箭头代表近端(黑色)和远端(白色)吻合。c)对ta4c3txmqd进行体内评估的实验时间表。供体移植物在移植前立即采集，并储存在冰冷的盐水中，直到移植到受体体内。外科手术完成后立即进行Ta4C3Tx MQDs的尾静脉注射。移植7天后收集血液和组织用于进一步分析。d，E)移植的腹主动脉段的H&E染色。在移植组中可以观察到明显的炎症迹象。此外，与载体对照相比，MQD治疗组的内皮增厚程度和外膜淋巴细胞浸润程度似乎有定量减少(插图和箭头)。 当与原生胸主动脉段归一化时，移植动物的主动脉段α-SMA相对表达明显优于对照组（0.8倍，MQDs1.4倍，p < 0.0001；图8B）。 与这些观察到的变化一致的是，与Ta4C3Tx MQDs处理的动物相比，对照组移植主动脉段内观察到更多的浸润外膜细胞毒性CD8+t淋巴细胞（图8C）。 图8.ta4c3txmqd体内免疫调节作用的定量评估。a)针对v-SMA的免疫组织化学显示了在移植动物中移植主动脉节段的介质中的显著破坏，这通过使用ta4c3txmqd的处理得以改善。b)使用平均荧光强度对v-SMA进行定量，并针对每只动物的非移植胸主动脉的一段进行标准化。赋形剂对照显示v-SMA的量显著下降，用ta4c3txmqd处理后有所改善。 c)与赋形剂对照组相比，在Ta4C3TxMQD处理组之间的移植主动脉节段的外膜中，观察到cd8+t-淋巴细胞浸润的定量减少(显示为红色)。d，E)动物循环T淋巴细胞的流式细胞分析。单个淋巴细胞通过CD3+CD4+门进行门控。如此处所示，主动脉移植组中CD25+调节性t淋巴细胞的数量较低，使用1 mgkg-1体重的静脉注射ta4c3txmqd治疗后有所改善。 结论 综上所述，本研究的分析介绍了免疫工程碳化钽（Ta4C3Tx）MXene量子点的合理设计、开发和应用。作为合成的Ta4C3Tx MQDs表现出高浓度的官能面基团，以促进其在生物医学应用中的作用。通过体外测试，这些Ta4C3Tx MQDs表现出与人内皮细胞的直接相互作用，同时保持良好的生物相容性。特别是，Ta4C3Tx MQDs被快速吸收到ec中，并通过调节表面共激活物和共抑制物分子来降低其激活异体t淋巴细胞的能力。此外，当应用于同种异体移植物血管病变的体内模型时，Ta4C3Tx显示出强大的免疫调节功能，并减少了同种异体移植物血管病变的早期发展。这项研究强调了合理设计的ta4c3txmqd在免疫工程和其他生物医学应用中的优势和未来的潜力。 |
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